袁春雷,譚家余，鐘裕恒,黃　湘△,陳敬林

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山博愛醫(yī)院:1.檢驗(yàn)科；2.中心ICU；3.產(chǎn)前診斷中心，廣東中山 528400)

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·論著·

HSPC238對(duì)肝癌細(xì)胞中RB基因表達(dá)的影響*

袁春雷1,譚家余2，鐘裕恒3,黃湘3△,陳敬林3

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山博愛醫(yī)院:1.檢驗(yàn)科；2.中心ICU；3.產(chǎn)前診斷中心，廣東中山 528400)

目的觀察HSPC238對(duì)肝癌細(xì)胞中RB mRNA和pRb蛋白水平的影響。方法將PcDNA3.1-HSPC238質(zhì)粒和PLL3.7-HSPC238干擾載體分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)RB mRNA的表達(dá)量;采用Western blotting法檢測(cè)pRb蛋白的表達(dá)。結(jié)果和對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染高表達(dá)HSPC238載體時(shí)，HepG2細(xì)胞中RB的mRNA水平和pRb表達(dá)量也增加；相反地，和對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染低表達(dá)HSPC238載體時(shí)，HepG2細(xì)胞中RB的mRNA水平和pRb蛋白的表達(dá)量也減少。以上結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論在HepG2細(xì)胞中HSPC238對(duì)RB基因的表達(dá)存在正向調(diào)控作用。

HSPC238；RB基因；肝癌細(xì)胞；HepG2

HSPC238是由LOC51255基因編碼的，含有153個(gè)氨基酸的C3HC4型鋅指蛋白。該蛋白于2000年登錄Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)。Brophy在2008年發(fā)現(xiàn)，該蛋白具有E3泛素連接酶活性[1]。在此基礎(chǔ)上，本課題組于2011年通過體內(nèi)外試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，HSPC238能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖[2]。但迄今為止，對(duì)HSPC238的功能認(rèn)識(shí)仍然很少。為了進(jìn)一步了解HSPC238在肝癌發(fā)病機(jī)制中的作用，本課題組設(shè)計(jì)了實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)和免疫印跡試驗(yàn)，探討外源性高表達(dá)或低表達(dá)HSPC238對(duì)RB mRNA和RB基因編碼的蛋白pRb的影響。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞和載體HepG2細(xì)胞購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。PcDNA3.1-HSPC238重組質(zhì)粒、PcDNA3.1空質(zhì)粒、PLL3.7-HSPC238干擾載體和PLL3.7陰性干擾載體均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2試劑HSPC238、pRB抗體和二抗均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。引物、組織RNA提取試劑盒均購(gòu)自美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司。反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR試劑購(gòu)自GeneCopoeia公司。HSPC238引物序列：上游5′-GTT GGT CCT GTG CGG TCA CT-3′，下游5′-GAA AGG CGA ACG TCT CAA CCT-3′；RB引物序列：上游5′-AAA AAG GTT CAA CTA CGC GTG TAA-3′，下游5′-GAG AGG TAG ATT TCA ATG GCT TCT G-3′；內(nèi)參序列GAPDH(251 bp)：上游5′-CCT GCA CCA CCA ACT GCT TAG-3′；下游5′-CAG TCT TCT GGG TGG CAG TGA-3′。HSPC238的干擾序列為5′-TGC TAT GAG CTG CCC ACT GAT TCA AGA GAT CAG TGG GCA GCT CAT AGC TTT TTT C-3′。引物均委托廣州英俊生物公司合成。PCR擴(kuò)增儀為ABI PRISM 7000 sequence detection system。

1.2方法

1.2.1HepG2細(xì)胞培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染將HepG2細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，放在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)24 h。等細(xì)胞的匯合度達(dá)到70%～80%時(shí)，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將PcDNA3.1-HSPC238質(zhì)粒、PcDNA3.1空質(zhì)粒、PLL3.7-HSPC238干擾載體和PLL3.7陰性對(duì)照載體分別轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞。各組在相同條件下培養(yǎng)48 h,然后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2RT-qPCR檢測(cè)HSPC238 mRNA表達(dá)(1)按試劑盒說明書，將HSPC238高表達(dá)組(HepG2/HSPC238)、高表達(dá)對(duì)照組(HepG2/empty)、低表達(dá)組(HepG2/KD)和低表達(dá)對(duì)照組(HepG2/NC)各組細(xì)胞分別提取RNA。將提取所得的RNA在紫外分光光度計(jì)上檢測(cè)其A260/A280比值和RNA濃度。當(dāng)A260/A280比值在1.8～2.0的時(shí)候，表明純度和濃度符合檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。再用1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質(zhì)量。(2)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得的cDNA -20 ℃保存。(3)參照qPCR反應(yīng)體系進(jìn)行qPCR反應(yīng)，以GAPDH作為內(nèi)參與HSPC238同時(shí)進(jìn)行PCR，每例樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)管。(4)將PCR產(chǎn)物作溶解曲線分析，確定產(chǎn)物特異性。

1.2.3免疫印跡試驗(yàn)(Western blotting)樣品處理后上樣，每例樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，GAPDH作為內(nèi)參，然后電泳，轉(zhuǎn)膜，加一抗(1∶500)反應(yīng)1.5 h,最后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗孵育后發(fā)光顯色。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理以2-△△Ct法表示相對(duì)定量結(jié)果：以GAPDH作為內(nèi)參，根據(jù)公式△Ct=[Ct(HSPC238)]-[Ct(GAPDH)]，△△Ct=[△Ct(試驗(yàn)組)]-[△Ct(對(duì)照組)]，2-△△Ct表示試驗(yàn)組HSPC238相對(duì)于對(duì)照組原始拷貝數(shù)的倍數(shù)差異，采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1HepG2/HSPC238組的HSPC238 mRNA表達(dá)水平是HepG2/empty組的(5.07±1.580)倍；HepG2/KD組的HSPC238 mRNA表達(dá)水平是HepG2/NC的(0.02±0.007)倍,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，如圖1a。HepG2/HSPC238組的RB mRNA表達(dá)水平是HepG2/empty (4.41±0.360)倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HepG2/KD組的RB mRNA表達(dá)水平是HepG2/NC的(0.71±0.110)倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，如圖1b。

圖1　　HSPC238、RB的mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.2HepG2/HSPC238組的pRb表達(dá)水平高于HepG2/empty組；HepG2/KD組的pRb表達(dá)水平低于HepG2/NC組，如圖2。

圖2　免疫印跡試驗(yàn)HSPC238和pRb蛋白檢測(cè)的表達(dá)水平

3　討　　論

HSPC238編碼的蛋白長(zhǎng)度為153個(gè)氨基酸，包含1個(gè)RING指結(jié)構(gòu)域，屬于C3HC4型鋅指蛋白，它具有E3泛素蛋白連接酶活性。鋅指蛋白是一類重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，鋅指蛋白可以通過RING指結(jié)構(gòu)介導(dǎo)蛋白與蛋白之間的相互作用，參與腫瘤的形成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、病毒復(fù)制等多種生物學(xué)過程(如RNF5、RNF125、mel-18等)[3-5]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，HSPC238可以通過影響ERK/MAPK通路抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，上調(diào)HSPC238使磷酸化的ERK1/2水平降低，反之使磷酸化ERK1/2水平增加，但HSPC238的改變不影響ERK1/2的總水平[2]。肝癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制中，ERK/MAPK信號(hào)通路的異常是至關(guān)重要的。pRb/E2F-1是ERK/MAPK通路的下游調(diào)控通路，是G1/S調(diào)控點(diǎn)的中心。前期通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的方法顯示，過表達(dá)HSPC238可延緩Bel7402細(xì)胞株從G1期進(jìn)入S期，表明 HSPC238可能通過影響細(xì)胞周期來抑制肝癌細(xì)胞Bel7402的生長(zhǎng)[6]?，F(xiàn)在通過本研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞HepG2中，過表達(dá)HSPC238可以同時(shí)使RB mRNA和pRb蛋白水平上升，低表達(dá)HSPC238可以使之下降，表明HSPC238可以通過調(diào)節(jié)RB mRNA和pRb的水平影響HepG2細(xì)胞G1/S進(jìn)程。結(jié)合之前的研究結(jié)果，說明HSPC238可以從胞漿到細(xì)胞核影響ERK/MAPK到pRb的通路，從而調(diào)控G1/S進(jìn)程。

P53也是細(xì)胞周期的重要調(diào)控點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)RPS27a可以顯著抑制通過MDM2介導(dǎo)的P53蛋白的泛素化降解，使得P53蛋白的分解顯著減少，然后引起細(xì)胞周期阻滯[7]。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞中HSPC238可以與RPS27a結(jié)合，同時(shí)可以正向調(diào)節(jié)RPS27a的表達(dá)，因此推測(cè)，在肝癌中HSPC238很可能通過結(jié)合并調(diào)節(jié)RPS27a，進(jìn)而阻礙MDM2泛素化降解p53[8-9]。如此而言，HSPC238很可能是pRb通路和p53通路的1個(gè)新連接點(diǎn)，像MDM2、p21、E2F-1、E2F7這些連接點(diǎn)一樣，在p53和pRb相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中起協(xié)調(diào)作用[10-13]。

由于本研究?jī)?nèi)容有限，HSPC238能否影響p53的表達(dá)水平，具體通過什么方式調(diào)節(jié)RB mRNA和pRb蛋白水平,還不得而知,是通過直接影響RB基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子起作用，還是通過MDM2、p21、E2F-1、E2F7這些連接點(diǎn)間接調(diào)節(jié)pRb，還需要大量研究證實(shí)，這也為后續(xù)研究提供了線索和方向。

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The effects of HSPC238 on the expression of RB in hepatoma carcinoma cells*

YUANChunlei1,TANJiayu2,ZHONGYuheng3,HUANGXiang3△,CHENJinglin3

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,ZhongshanBoaiHospitalAffiliatedtoSouthernMedicalUniversity,Zhongshan,528400,China;2.CentralIntensiveCareUnit,ZhongshanBoaiHospitalAffiliatedtoSouthernMedicalUniversity,Zhongshan,528400,China;3.PrenatalDiagnosisCenter,ZhongshanBoaiHospitalAffiliatedtoSouthernMedicalUniversity,Zhongshan,528400,China)

ObjectiveTo investigate the effect of up-regulation and down-regulation of HSPC238 on the RB gene mRNA and pRb protein.MethodsPcDNA3.1-HSPC238 vector and PLL3.7-HSPC238 vector was transiently transfected into HepG2 cells respectively.The level of RB mRNA was detected by real-time PCR and pRb was detected by Western blotting.ResultsThe level of RB mRNA and pRb in up-regulation group both increased compared with control grops respectively.Conversely,the level of RB mRNA and pRb in up-regulation group both decreased compared with control grops respectively.Above results were all statistically significant(P<0.05).ConclusionHSPC238 could have a positive effect on the expression of the RB gene.

HSPC238；RB gene；hepatoma carcinoma；HepG2

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81101534)；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(S2012010010824)。

袁春雷，男，副主任技師，主要從事臨床檢驗(yàn)方面的研究?！?/p>

,E-mail:340382761@qq.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.18.001

A

1673-4130(2016)18-2505-03

2016-04-21

2016-06-28)