吳玉鵬，趙曉梅

（1.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆昌吉831100；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物質(zhì)能源研究所，新疆烏魯木齊830091）

庫(kù)爾勒香梨萼端黑斑病發(fā)病規(guī)律及生理變化的研究

吳玉鵬1，趙曉梅2，*

（1.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆昌吉831100；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物質(zhì)能源研究所，新疆烏魯木齊830091）

為了提高庫(kù)爾勒香梨對(duì)萼端黑斑病的抗病性，先采用0.014%Ca、2.0 μL/L 1-MCP、0.014%Ca和2.0 μL/L 1-MCP相結(jié)合的方法處理庫(kù)爾勒香梨果實(shí)，提高其抗病性；再反接入萼端黑斑病病原菌，研究常溫條件下病斑的發(fā)病情況及生理活性的變化。試驗(yàn)結(jié)果表明，采前噴施0.014%液鈣能夠抑制庫(kù)爾勒香梨果實(shí)萼端黑斑病病原菌的橫向生長(zhǎng)；采后2.0 μL/L 1-MCP處理可抑制果實(shí)呼吸強(qiáng)度，提高果實(shí)的PAL活性；（采前0.014%鈣+采后2.0 μL/L 1-MCP）能夠可以提高果實(shí)中的總酚含量，抑制縱向生長(zhǎng)和果實(shí)乙烯的釋放，延緩果實(shí)衰老；對(duì)照能使果實(shí)保持較高的β-1，3葡聚糖酶活性。

庫(kù)爾勒香梨；萼端黑斑?。话l(fā)病規(guī)律；生理變化

庫(kù)爾勒香梨采后萼端黑斑病和黑心病是因?yàn)楣麑?shí)品質(zhì)下降和缺鈣引起的生理病害［1］，鈣［2］和1-MCP［3］在提高果實(shí)品質(zhì)、延緩果實(shí)衰老方面具有重要的作用。本試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，先采用一定濃度的鈣處理、1-MCP處理以及鈣和1-MCP組合處理正常果實(shí)，再在這些處理和對(duì)照果實(shí)上反接入庫(kù)爾勒香梨萼端黑斑病病原菌，研究常溫條件下病斑直徑、病斑深度的發(fā)病情況及呼吸強(qiáng)度、乙烯釋放量、總酚含量，PAL和β-1，3葡聚糖酶活性的變化，分析果實(shí)感病后生理活性的變化規(guī)律，從而篩選出抗病的處理?xiàng)l件，旨為庫(kù)爾勒香梨的貯藏保鮮提供豐富的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料、儀器與試劑

1.1.1試驗(yàn)材料

在巴州輪臺(tái)縣新疆農(nóng)科院輪臺(tái)國(guó)家果樹資源圃王德福果園進(jìn)行。在庫(kù)爾勒香梨座果2周～6周內(nèi)，每隔1周采用0.014%液鈣肥噴灑樹體葉片1次，以清水為對(duì)照，噴施3次。單株小區(qū)，重復(fù)3次。

1.1.2試驗(yàn)試劑

乙醇、硼砂、硼酸、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、乙二胺四乙酸（EDTA）、β-巰基乙醇、L-苯丙氨酸、濃鹽酸、冰醋酸、無(wú)水醋酸鈉：均為分析純?cè)噭?/p>

液鈣肥：由北京雷力有限公司提供；1-MCP：由武漢遠(yuǎn)城發(fā)展有限公司提供；MAP采用聚乙烯（PE）材料：由新疆巨合科技有限責(zé)任公司提供。

1.1.3儀器設(shè)備

移液槍、Telaire 7001二氧化碳分析儀：北京寶云興業(yè)科貿(mào)有限公司；FK-A組織搗碎機(jī)：常州翔天實(shí)驗(yàn)儀器廠；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇金壇金偉實(shí)驗(yàn)儀器廠；CP214電子天平（Max：210 g，d=0.000 1 g）：奧豪斯儀器（上海）有限公司；電子天平（Max：10 kg，e=5 d，d=1 g）、80-1電動(dòng)離心機(jī)、FCD-270SC N海爾冰柜、DHG-9240A電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司；78HW-1磁力攪拌器：常州翔天實(shí)驗(yàn)儀器廠；GL-20G-Ⅱ型高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；TU-1810型紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；氣象色譜儀（主機(jī)：日本島津2014C；工作站：GCsolution）。

1.2試驗(yàn)處理

1.2.11-MCP處理

采前噴鈣和對(duì)照果實(shí)采摘后立刻運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，剔除病果和爛果，挑選成熟度一致、大小一致的果實(shí)，預(yù)冷24 h。將噴鈣和對(duì)照果實(shí)（各15 kg）放入由PE膜（厚0.1 mm）制成的1 m3密封帳中，將2片1-MCP片劑放入50 mL燒杯中，放入PE帳內(nèi)，加入50 mL無(wú)離子水，輕搖，迅速密封PE帳，其產(chǎn)生的1-MCP量為2.0 μL/L，在25℃條件下，熏蒸7 h～8 h后，揭開PE帳，通風(fēng)30 min。

表1　試驗(yàn)處理Table 1Experimental treatment

1.2.2各處理接種庫(kù)爾勒香梨采后萼端黑斑病病原菌

首先將庫(kù)爾勒香梨萼端黑斑病病原菌制成孢子懸浮液（1×106個(gè)孢子/mL），從4個(gè)處理中選取相同量的果實(shí)，分別用75%酒精擦洗3遍，然后用滅菌鐵釘沿果實(shí)赤道線對(duì)稱位置刺2個(gè)直徑3 mm、深度4 mm的小孔，用移液槍吸取30 μL菌液打入傷口，使用透明膠帶將孔的四周全部密封，形成一個(gè)密閉的內(nèi)環(huán)境。置于常溫（25℃，70%～80%RH）避光環(huán)境下，12 h后，進(jìn)行各指標(biāo)初值的測(cè)定。

每隔4天，測(cè)定果肉細(xì)胞的病斑直徑、病斑深度、呼吸強(qiáng)度、乙烯、總酚含量、PAL活性、β-1，3葡聚糖酶活性。

1.3測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1病斑直徑及深度

用直尺在病斑處進(jìn)行十字交叉法測(cè)量病斑直徑，再沿著接種處將果實(shí)橫向切開，用直尺測(cè)量病斑深度，每個(gè)處理重復(fù)3次，單位cm。

1.3.2呼吸強(qiáng)度

用Telaire 7001二氧化碳分析儀測(cè)定果實(shí)呼吸強(qiáng)度，每處理重復(fù)3次。

1.3.3乙烯

1.3.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取300 mL樣品瓶，倒置，將氮?dú)鈱?dǎo)管伸入瓶中充分通氣，將瓶中空氣排出。經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間排氣后，用橡膠塞密封瓶口。再往樣品瓶中注射一定量的標(biāo)準(zhǔn)乙烯，分別配制含量為0、5、10、15、20（μL/L）的乙烯氣體，充分搖動(dòng)。然后用注射器從容器橡膠塞上取1.0 mL氣體，在氣相色譜儀上進(jìn)樣測(cè)定，確定乙烯出峰時(shí)間，以峰面積為橫坐標(biāo)、乙烯濃度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.2色譜條件

氫火焰離子檢測(cè)器：FID；色譜柱：GSBP-inowaxms彈性毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 mm）；進(jìn)樣口溫度：100℃，檢測(cè)器溫度：120℃，柱溫：40℃，進(jìn)樣量：1 mL。分流比：30∶1；H2流速：50 kp（kp即皮托管系數(shù)）；氣流（Air）流速：50 kp；N2流速：50 kp。

1.3.3.3氣體收集與測(cè)定

將玻璃容器打開，倒扣放置，使容器中氣體與空氣平衡。然后放入1 kg左右果實(shí)，在室溫下密閉1 h。用注射器從容器橡膠塞取氣口中頂空取1.0 mL氣體，在氣相色譜儀上測(cè)定。經(jīng)色譜儀檢測(cè)后得到色譜圖，加載標(biāo)準(zhǔn)曲線后（面積外標(biāo)法），經(jīng)過(guò)微機(jī)處理，即可得到進(jìn)樣氣體乙烯濃度（ppm；μL/L）。

式中：C為氣相色譜測(cè)定的樣品氣體中乙烯含量，μL/L；V為玻璃容器密閉空間的容積，mL；t為測(cè)定時(shí)間，h；W為果實(shí)重量，kg。

1.3.4總酚［4］

1.3.4.1酚類物質(zhì)的提取

取10個(gè)梨果實(shí)，在果實(shí)的相同部位取組織塊2.5g，共25 g，加入50 mL無(wú)水乙醇，加入25 mL 10%三氯乙酸，高速離心機(jī)10 000 r/min勻漿2 min，然后用10%三氯乙酸定容到100 mL，靜置24 h，8 000 r/min離心15 min，沉淀用1 mol/LNaOH洗滌3次，收集上清液混勻，用鹽酸調(diào)整溶液的pH到8.0，供非水溶性酚類物質(zhì)測(cè)定。

1.3.4.2制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

取6支試管，分別加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL（100μg/mL）標(biāo)準(zhǔn)沒食子酸溶液，加水至1mL。加入3mL 0.1 mol/L的Folin試劑后混勻，再加入1 mL堿試劑，充分混勻，50℃水浴保溫15 min，然后在650 nm波長(zhǎng)處比色，以沒食子酸含量為橫坐標(biāo)，以光密度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.3樣品測(cè)定

取適當(dāng)稀釋的樣品液1 mL，加入3 mL Folin試劑和1 mL堿液，測(cè)定過(guò)程與標(biāo)準(zhǔn)曲線制作相同。

1.3.5苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性［4］

1.3.5.1酶液制備

稱取5.0 g果實(shí)組織樣品，置于研缽中，加入5.0 mL提取緩沖液，在冰浴條件下研磨成勻漿。將勻漿液全部轉(zhuǎn)入到離心管中，于4℃、8 000 r/min離心30 min，收集上清液，即為粗酶提取液，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5.2活性的測(cè)定

取兩支試管，分別加入3.0 mL 50 mmol/L pH 8.8硼酸緩沖液、0.5 mL 20 mmol/L L-苯丙氨酸。向一支管中加入0.5 mL酶提取液，另一支管中加入0.5 mL經(jīng)煮沸5 min失活酶液作為對(duì)照。然后，將兩支反應(yīng)管置于37℃保溫60 min。保溫結(jié)束時(shí)立即向兩支反應(yīng)管中分別加入0.1 mL 6 mol/L鹽酸溶液終止反應(yīng)。以蒸餾水為參比空白調(diào)零，分別測(cè)定樣品反應(yīng)管和對(duì)照反應(yīng)管中溶液在波長(zhǎng)290 nm處的吸光度值（ODS和ODC）。重復(fù)3次。以每小時(shí)每克鮮重（FW）組織反應(yīng)體系吸光度值增加0.01時(shí)為1個(gè)PAL活性單位（U），表示為0.01△OD290·h-1·g-1FW。

式中：ODS為樣品管反應(yīng)溶液的吸光度值；ODC為對(duì)照管反應(yīng)溶液的吸光度值；V為樣品提取液總體積，mL；VS為測(cè)定時(shí)所取樣品提取液體積，mL；t為酶促反應(yīng)時(shí)間，h；W為樣品重量，g。

1.3.6β-1，3葡聚糖酶（GLU）活性［4］

1.3.6.1酶液提取

稱取10.0 g果實(shí)組織樣品，置于研缽中，加入10 mL經(jīng)預(yù)冷的提取緩沖液，在冰浴條件下研磨成勻漿。將勻漿液全部轉(zhuǎn)入到離心管中，于4℃、8 000 r/min離心30 min，收集上清液，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6.2活性測(cè)定

取兩支反應(yīng)管，分別加入100 μL 0.4%的昆布多糖溶液。然后，向一支管中加入100 μL酶液，向另一支管中加入100 μL經(jīng)煮沸5 min的酶液作為對(duì)照，混勻。將反應(yīng)管置于37℃保溫40 min。保溫后向反應(yīng)管中加入1.8 mL蒸餾水和1.5 mL DNS試劑，在沸水浴中加熱3 min。再用蒸餾水將顯色的反應(yīng)液稀釋至25 mL，混勻。測(cè)定混合液在540 nm處的吸光度值。重復(fù)3次。

式中：C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的葡萄糖量，mg；V為樣品提取液總體積，mL；VS為測(cè)定時(shí)所取樣品提取液體積，mL；t為酶促反應(yīng)時(shí)間，s；W為樣品重量，g；180為葡萄糖相對(duì)分子質(zhì)量。

1.4數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Excel 2010軟件制作曲線圖。

2　結(jié)果與分析

2.1果實(shí)病斑直徑的變化

病斑直徑能夠從橫切面角度反映出病斑面積的大小，因而可作為判斷病害危害程度的重要指標(biāo)，見圖1。

圖1　接種后庫(kù)爾勒香梨病斑直徑的變化Fig.1Changes of lesion diameter of Korla fragrant pear after inoculation

各處理庫(kù)爾勒香梨果實(shí)接種萼端黑斑病病原菌后，各處理的病斑直徑都呈不斷上升的變化趨勢(shì)，按照大小順序排列依次為：處理2＞處理3＞處理4＞處理1，說(shuō)明處理1，即采前采用0.014%液鈣噴施庫(kù)爾勒香梨樹體，能更好地抑制果實(shí)萼端黑斑病病原菌的橫向生長(zhǎng)。

2.2果實(shí)病斑深度的變化

病斑深度能夠從縱切面角度反映出病斑侵入果實(shí)內(nèi)部的深度，因而可作為判斷病害危害程度的重要指標(biāo)，見圖2。

圖2　接種后庫(kù)爾勒香梨病斑深度的變化Fig.2Changes of lesion depth of Korla fragrant pear after inoculation

隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理庫(kù)爾勒香梨果實(shí)接種萼端黑斑病病原菌后，各處理的病斑深度逐漸增加，按照大小順序排列依次為：處理3＞處理4＞處理1＞處理2，處理2即采前采用0.014%液鈣噴施庫(kù)爾勒香梨樹體，結(jié)合采后2.0 μL/L 1-MCP處理，能更好地抑制果實(shí)萼端黑斑病病原菌縱向生長(zhǎng)。

2.3果實(shí)呼吸強(qiáng)度的變化

呼吸作用是果蔬采收后進(jìn)行的生理活動(dòng)，呼吸強(qiáng)度可反映呼吸作用的強(qiáng)弱，果實(shí)感病后呼吸強(qiáng)度會(huì)顯著增加，見圖3。

圖3　接種后庫(kù)爾勒香梨呼吸強(qiáng)度的變化Fig.3Changes of respiration rate of Korla fragrant pear after inoculation

處理1、處理2和處理3果實(shí)的呼吸強(qiáng)度都在第5天達(dá)到呼吸高峰，分別為15.90、10.56、7.19 mg/（kg·h），按照呼吸強(qiáng)度的高低排列：處理1＞處理2＞處理4＞處理3。

2.4果實(shí)乙烯釋放量的變化

乙烯能促進(jìn)果實(shí)的后熟衰老過(guò)程。通過(guò)收集各處理果實(shí)釋放的乙烯樣品，利用氣相色譜法測(cè)定乙烯濃度，計(jì)算乙烯釋放量，見圖4。

圖4　接種后庫(kù)爾勒香梨乙烯釋放量的變化Fig.4Changes of ethylene production of Korla fragrant pear after inoculation

各處理果實(shí)乙烯的釋放量變化一致，都在第1天下降，3天后急劇上升，第5天達(dá)到峰值，之后又開始迅速下降。按照乙烯釋放量大小的順序排列：處理4＞處理1＞處理3＞處理2。

2.5果實(shí)PAL活性的變化

苯丙氨酸解氨酶（PAL）在植物生長(zhǎng)發(fā)育和抵御病害方面起著重要的作用，見圖5。

圖5　接種后庫(kù)爾勒香梨PAL活性的變化Fig.5Changes of phenylalamine ammonia lyase activity of Korla fragrant pear after inoculation

處理1和處理3果實(shí)的PAL活性變化一致，初期都是先逐漸下降，分別在第9天和13天達(dá)到最低值，之后又迅速上升；和處理2和處理4相比，處理1和處理3果實(shí)的PAL活性較高，其中處理3能更好地推遲谷值的來(lái)臨，使PAL活性保持在較高的水平，因而抗病性也較強(qiáng)。

2.6果實(shí)GLU活性的變化

當(dāng)植物體被外界微生物侵染時(shí)，β-1，3葡聚糖酶活性會(huì)顯著提高，用來(lái)增強(qiáng)植物體的抗逆性，見圖6。

圖6　接種后庫(kù)爾勒香梨GLU活性的變化Fig.6Changes of β-1，3-glucanase activity of Korla fragrant pear after inoculation

整個(gè)貯藏期內(nèi)，除處理3外，其它處理果實(shí)的β-1，3葡聚糖酶活性均呈現(xiàn)峰值的變化，并且都是在第9天達(dá)到高峰，按照活性高低的順序排列：處理4＞處理1＞處理3＞處理2，該順序與乙烯釋放量的一致，說(shuō)明處理4果實(shí)對(duì)病害的抵抗能力較強(qiáng)。

2.7果實(shí)總酚含量的變化

植物多酚是植物體內(nèi)重要的次生代謝物質(zhì)。極端環(huán)境下，植物通過(guò)形態(tài)變化和次生代謝物質(zhì)等來(lái)抵御極端環(huán)境脅迫，見圖7。

圖7　接種后庫(kù)爾勒香梨總酚含量的變化Fig.7Changes of phenolic content of Korla fragrant pear after inoculation

各處理果實(shí)的總酚含量均呈現(xiàn)峰值的變化。處理2果實(shí)中的總酚含量是在第13天達(dá)到高峰，其它處理都在第9天達(dá)到高峰?？偡雍康母叩团判颍禾幚?＞處理3＞處理1＞處理4，說(shuō)明采前噴施0.014%液鈣結(jié)合采后2.0 μL/L 1-MCP處理，能更好地提高次生代謝物質(zhì)-酚類物質(zhì)含量，使果實(shí)能夠增強(qiáng)抵御病害的能力。

3　討論

采前噴施0.014%液鈣能夠抑制果實(shí)萼端黑斑病病原菌的橫向生長(zhǎng)；采前噴施0.014%液鈣，結(jié)合采后2.0 μL/L 1-MCP處理可抑制病原菌縱向生長(zhǎng)及果實(shí)乙烯的釋放，提高貯藏后期果實(shí)的總酚含量；采后2.0μL/L 1-MCP處理能更好地抑制果實(shí)的呼吸強(qiáng)度，提高果實(shí)的PAL活性；而處理4（CK）果實(shí)中的β-1，3葡聚糖酶活性最高，抵抗病害侵染的能力較強(qiáng)。1-MCP處理能明顯抑制果實(shí)的呼吸作用，這與‘綠寶石’梨［5］、黃金梨［6］上的研究結(jié)果一致。1-MCP處理能明顯降低果實(shí)的呼吸強(qiáng)度和乙烯釋放量以及果皮和果肉組織的總酚含量，與1-MCP在酥梨［7］、黃金梨［6］、秀豐梨［8］、鴨梨［9］上的結(jié)論不完全一致。與吳愛現(xiàn)等［10］的1%和3%的浸鈣處理，均可降低豐水梨果實(shí)貯藏期間呼吸強(qiáng)度研究結(jié)果不一致。

4　小結(jié)

1）采前噴施0.014%液鈣能夠抑制庫(kù)爾勒香梨果實(shí)萼端黑斑病病原菌的橫向生長(zhǎng)；

2）處理3（采前0.014%鈣+采后2.0 μL/L 1-MCP）可以提高果實(shí)中的總酚含量，抑制縱向生長(zhǎng)和果實(shí)乙烯的釋放，延緩果實(shí)衰老；

3）采后2.0 μL/L 1-MCP處理可抑制果實(shí)呼吸強(qiáng)度，提高果實(shí)的PAL活性；

4）處理4（CK）能使果實(shí)保持較高的β-1，3葡聚糖酶活性。

［1］賈曉輝，王文輝，李世強(qiáng)，等.庫(kù)爾勒香梨萼端黑斑病發(fā)生的原因［J］.果樹學(xué)報(bào)，2010，27（4）：556-560

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Study on the Occurrence Regularity of Calyx End Black Spot and Physiological Changes in Korla Fragrant Pear

WU Yu-peng1，ZHAO Xiao-mei2，*
（1.Xinjiang Vocational College of Agriculture，Changji 831100，Xinjiang，China；2.Research Institute of Bioenergy，Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi 830091，Xinjiang，China）

In order to improve the disease resistance to calyx end black spot of Korla fragrant pear，the test used 0.014%Ca，2.0 μL/L 1-MCP and Ca 0.014%combined with 2.0 μL/L 1-MCP to deal with Korla fragrant pear for improving the disease resistance.It studied the onset of disease spot under the condition of normal temperature and the change of physiological activity when accessed the calyx end black rot pathogen again.The test results showed that spraying 0.014%calcium preharvest could inhibit the Korla fragrant pear fruit calyx end black rot pathogen lateral growth；2.0 μL/L 1-MCP postharvest treatment inhibited the fruit respiration intensity and improved the PAL activity of the fruit；（Spraying 0.014%calcium preharvest+2.0 μL/L 1-MCP postharvest treatment），could improve the total phenol content in fruit and inhibited the growth of longitudinal and ethylene release，fruit senescence；Contrast could make the fruit to keep high beta 1，3 glucanase activity.

Korla fragrant pear；calyx end black spot；occurrence regularity；physiological changes

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.17.043

2015-10-18

自治區(qū)財(cái)政林業(yè)科技專項(xiàng)資金項(xiàng)目“采前噴鈣對(duì)庫(kù)爾勒香梨黑心病控制技術(shù)的推廣與示范”

吳玉鵬（1979—），男（漢），講師，碩士，主要從事果樹、蔬菜栽培方面的研究。

趙曉梅（1980—），女，副研究員，博士，主要從事果樹學(xué)方面的研究。