房磊

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林吉林132101）

超聲波輔助提取銀杏葉黃酮及體外抗運(yùn)動(dòng)氧化作用研究

房磊

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林吉林132101）

研究超聲波輔助提取銀杏葉黃酮及其體外抗運(yùn)動(dòng)氧化作用。在單因素基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲波輔助提取銀杏葉黃酮工藝，并分析銀杏葉黃酮對(duì)小鼠肝組織丙二醛（MDA）、總抗氧化能力（T-AOC）的影響。結(jié)果表明：最佳工藝為提取功率80 W、提取時(shí)間40 min、提取溫度70℃、料液比1∶25（g/mL），此條件下黃酮得率為27.32 mg/g。銀杏葉黃酮能顯著降低小鼠肝組織中MDA的含量（P＜0.05），能提高小鼠肝組織中T-AOC水平，表明銀杏葉黃酮可增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力。

銀杏葉；黃酮；超聲波輔助提取；抗氧化

銀杏（Ginkgo biloba）是我國(guó)特有的寶貴資源。銀杏葉中活性成分非常多，其中含有黃酮類化合物以及其他成分，能夠抗氧化、改善心腦血管循環(huán)以及抗病毒、防止衰老、防止過(guò)敏、使膽固醇降低等功效，銀杏葉提取物安全可靠，食用健康［1-2］。它可用于加工藥品、保健食品等［3-4］。銀杏葉中黃酮含量高，提取方法較多，用水可以提出黃酮，微波、超聲波都可以用于提取黃酮。超聲波法優(yōu)點(diǎn)多，它可以節(jié)省能量、時(shí)間以及提高提取率等［5-6］。超聲波輔助提取方法是一種提取成分的新技術(shù)，通過(guò)超聲波作用能夠改變細(xì)胞膜通透性，使得萃取過(guò)程得到優(yōu)化，能夠增強(qiáng)提取效果［7］。超聲波輔助提取法能夠大大地提高有機(jī)物提取率，提高提取效率［8］。補(bǔ)充黃酮類物質(zhì)可增強(qiáng)人體抗氧化且有利于運(yùn)動(dòng)機(jī)體減少自由基的產(chǎn)生和加速其清除［9-10］，用來(lái)對(duì)抗自由基的副作用，銀杏葉黃酮類物質(zhì)可延緩運(yùn)動(dòng)性氧化發(fā)生和加快體能恢復(fù)，因而對(duì)一般人和運(yùn)動(dòng)員的健康都有益［11-12］。本文采用超聲波輔助提取銀杏葉黃酮，并研究其抗運(yùn)動(dòng)氧化作用，為開(kāi)發(fā)銀杏葉黃酮類保健產(chǎn)品提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

銀杏葉：安國(guó)市健仁藥材有限公司；NaNO2、Al（NO3）3、NaOH、無(wú)水乙醇：匯普試劑有限公司；蘆丁（純度＞95%）：西安瑞林生物科技有限公司；清潔級(jí)ICR小鼠，80只，雌雄各半，重量25 g～27 g：宜昌明德農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司，合格證號(hào)SCXK2014-0009。

1.2儀器與設(shè)備

UV1800PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海奧析科學(xué)儀器有限公司；UC-900A1型數(shù)控超聲波輔助清洗機(jī)：廣州維力超聲電子設(shè)備有限公司；AHC型電子計(jì)數(shù)秤：嘉興市惠拓稱重設(shè)備有限公司；SHY-2恒溫水浴振蕩器：常州市萬(wàn)豐儀器制造有限公司；DZF-6030型真空干燥箱：上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；LD5-2A型離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)有限公司；總抗氧化能力（T-AOC）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20100311）、丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20100322）、超氧化物酶（SOD）測(cè)試盒（批號(hào)：20100324）：南京建成生物工程公司。

1.3方法

1.3.1銀杏葉黃酮的提取方法

準(zhǔn)確稱取一定量的銀杏葉，將其剪成0.3 cm×0.3 cm碎片，加入一定濃度乙醇，利用超聲波輔助提取銀杏葉中的黃酮，然后進(jìn)行過(guò)濾，得到濾液待測(cè)。

1.3.2銀杏葉黃酮含量測(cè)定

取蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，于510 nm處測(cè)定其標(biāo)準(zhǔn)曲線，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A=10.760 5C+0.003 6（R2=0.999 8），式中C為黃酮濃度，g/L；A為吸光度值。1 mL待測(cè)液體，取乙醇濃度為30%的溶液將其稀釋至5 mL，混合完畢再加入0.3 mL 5%NaNO2溶液，靜置5min，再加0.3mL10%Al（NO3）3溶液，靜放6min，再加4 mL 1 mol/LNaOH溶液及0.4 mL 30%乙醇溶液，混勻后靜置10 min，于510 nm下測(cè)定其吸光度。

1.3.3單因素試驗(yàn)

分別以提取功率（60、70、80、90、100 W）、提取時(shí)間（30、35、40、45、50 min）、提取溫度（40、50、60、70、80℃）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）（g/mL）為影響因素，分別設(shè)定5個(gè)水平，研究各個(gè)因素對(duì)提取液中銀杏葉黃酮含量的影響。

1.3.4正交試驗(yàn)對(duì)銀杏葉黃酮提取工藝的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝參數(shù)。試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1　因素與水平Table 1Factors and levels

1.3.5脂質(zhì)過(guò)氧化小鼠實(shí)驗(yàn)［13］

把所取的80只小鼠分成4組，各組名稱為對(duì)照組、四氯化碳組、陽(yáng)性對(duì)照組、銀杏葉黃酮組。對(duì)照組以及四氯化碳組灌胃生理鹽水10 mg/（kg·d），陽(yáng)性對(duì)照組（VE組）灌胃VE1.0 mg/（kg·d），黃酮組小鼠灌提取黃酮95 mg/（kg·d），不間斷灌胃15 d。末次灌胃后2 h，將對(duì)照組注射橄欖油液體，其他組均注射0.1%CCl4橄欖油液體10 mg/（kg·d）。禁止吃食，16 h后分別取血。以3 500 r/min離心10 min，取血清，測(cè)定MDA含量和T-AOC、SOD活性；同時(shí)稱量一定量肝組織，冷鹽水洗凈，制成10%肝勻漿，以4 000 r/min離心10 min，取上清液，測(cè)定MDA含量、T-AOC水平。采用硫代巴比妥酸比色法測(cè)定MDA含量，應(yīng)用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定T-AOC水平和SOD活性，具體步驟參照各試劑盒說(shuō)明書(shū)。

2　結(jié)果與分析

2.1超聲波輔助提取銀杏葉黃酮單因素試驗(yàn)

2.1.1提取功率對(duì)銀杏葉黃酮得率的影響

稱取5 g按標(biāo)準(zhǔn)剪好的銀杏葉，向其中加入100 mL 70%乙醇，在提取溫度60℃，提取功率分別為60、70、80、90、100 W條件下提取40 min，以考察提取功率對(duì)銀杏葉黃酮得率的影響。提取功率對(duì)黃酮得率的影響見(jiàn)圖1。

圖1　提取功率對(duì)黃酮得率的影響Fig.1Effect of extraction power on flavonoids yield

由圖1可知，當(dāng)提取功率為60 W時(shí)，黃酮得率較小，隨著提取功率的增大，黃酮得率最高，原因可能是隨著功率增大，使得溶劑擴(kuò)散越快，越有利于黃酮的浸出，當(dāng)功率為80 W時(shí)，黃酮得率最高，再增大提取功率后，黃酮得率開(kāi)始下降，原因可能是功率過(guò)高，產(chǎn)生的瞬時(shí)高溫會(huì)使許多活性成分遭到破壞，雜質(zhì)溶出較多且操作不便［14-15］，所以選擇70、80、90 W為多因素研究水平。

2.1.2提取時(shí)間對(duì)銀杏葉黃酮得率的影響

稱取5 g剪好的銀杏葉，分別加入100 mL 70%乙醇，在提取溫度60℃，提取功率80 W條件下分別提取30、35、40、45和50 min，以考察提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響。提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響見(jiàn)圖2。

圖2　提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響Fig.2Effect of extraction time on flavonoids yield

由圖2可知，隨著提出時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮得率逐漸提高，當(dāng)時(shí)間為40 min時(shí)，黃酮得率最高，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間，黃酮得率下降。超聲波能夠促使黃酮進(jìn)入溶液中，而且在較短時(shí)間內(nèi)就可看到效果，但是過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的超聲波作用可能導(dǎo)致部分黃酮發(fā)生降解，黃酮含量也隨之下降［16］，因此選擇35、40、45 min為多因素研究水平。

2.1.3提取溫度對(duì)銀杏葉黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱量5 g按照標(biāo)準(zhǔn)剪好的銀杏葉，向其中加入100 mL 70%乙醇，在提取功率80 W，提取溫度分別為40、50、60、70、80℃的情況下，提取40 min，以考察提取溫度對(duì)銀杏葉黃酮含量的影響。取溫度對(duì)黃酮得率的影響見(jiàn)圖3。

圖3　提取溫度對(duì)黃酮得率的影響Fig.3Effect of extraction temperature on flavonoids yield

由圖3可知，銀杏葉黃酮含量隨著提取溫度的升高而增大，當(dāng)提取溫度達(dá)到60℃時(shí)，黃酮得率最大，繼續(xù)升高溫度，黃酮得率下降，原因可能是溫度過(guò)高后破壞了黃酮分子的結(jié)構(gòu)致使黃酮含量減少［17］。因此選擇50、60、70℃為多因素研究水平。

2.1.4料液比對(duì)銀杏葉黃酮得率的影響

準(zhǔn)確量取5 g按照標(biāo)準(zhǔn)剪好的銀杏葉，向其中加入50、75、100、125、150 mL濃度為70%乙醇溶液，在溫度60℃，功率80 W情況下提取40 min，以考察料液比對(duì)黃酮含量的影響。料液比對(duì)黃酮得率的影響見(jiàn)圖4。

圖4　料液比對(duì)黃酮得率的影響Fig.4Effect of liquid ratio on flavonoids yield

根據(jù)圖4能夠看出，當(dāng)料液比為1∶10（g/mL）時(shí)，黃酮得率最低，當(dāng)液體逐漸增加后，黃酮得率上升，當(dāng)料液比達(dá)到1∶20（g/mL）后，進(jìn)一步增加溶劑量，黃酮含量的變化不明顯，幾乎不變，原因可能是原料一定的情況下，黃酮溶出率一定，繼續(xù)增加溶劑含量不會(huì)提高黃酮的溶出率［18］，因此選擇料液比為1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）為多因素研究水平。

2.2超聲波輔助提取銀杏葉黃酮正交試驗(yàn)結(jié)果與分析利用軟件SPSS16.0對(duì)本試驗(yàn)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表2和表3。

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2Orthogonal test results

表3　正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3Variance analysis of orthogonal array design experimental results

由表3可以看出，提取功率、提取時(shí)間、提取溫度、料液比對(duì)超聲波輔助提取銀杏葉黃酮得率的影響均極顯著。各因素對(duì)銀杏葉黃酮得率的影響大小依次是提取時(shí)間＞提取功率＞提取溫度＞料液比，根據(jù)表2可知，最優(yōu)試驗(yàn)方案是A2B2C3D3，不在9組試樣中，對(duì)組別A2B2C3D3進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，其得率為（27.32± 0.24）（mg/g），故A2B2C3D3為最優(yōu)組合。即提取功率為80 W、提取時(shí)間為40 min、提取溫度為70℃、料液比為1∶25（g/mL）。在此條件下銀杏葉黃酮得率為（27.32± 0.24）（mg/g）。

2.3銀杏葉黃酮體內(nèi)抗氧化活性指標(biāo)分析

2.3.1銀杏葉黃酮對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化小鼠肝臟指標(biāo)的影響

測(cè)定脂質(zhì)過(guò)氧化小鼠肝勻漿中MDA含量和TAOC水平，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　銀杏葉黃酮對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化小鼠肝勻漿各指標(biāo)的影響（±s，n=20）Table 4Effect of Ginkgo biloba flavonoids on lipid peroxidation in rat liver homogenates（±s，n=20）

表4　銀杏葉黃酮對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化小鼠肝勻漿各指標(biāo)的影響（±s，n=20）Table 4Effect of Ginkgo biloba flavonoids on lipid peroxidation in rat liver homogenates（±s，n=20）

注：▲表示與空白對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05）；▲▲表示與空白對(duì)照組比較有極顯著性差異（P＜0.01）；*表示與四氯化碳組比較有顯著性差異（P＜0.05）；**表示與四氯化碳組比較有極顯著性差異（P＜0.01）。

組別劑量/（mg/kg）MDA含量/（nmol/mg）T-AOC/（U/mg）空白對(duì)照組4.54±1.211.34±0.13四氯化碳組6.73±1.87▲▲0.75±0.22▲▲銀杏葉黃酮組953.87±1.91*1.62±0.33*VE組951.68±0.23**1.21±0.22**

通過(guò)表4能夠得出，銀杏葉黃酮組與空白組相比較，能夠顯著降低小鼠肝組織中MDA含量（P＜0.05），小鼠肝組織里T-AOC水平明顯升高，同四氯化碳組相比差異顯著（P＜0.05），從而可得出銀杏葉黃酮組可降低肝組織細(xì)胞過(guò)氧化速度，抑制肝勻漿中生成MDA，從而提高小鼠抗氧化能力，說(shuō)明銀杏葉黃酮具有抗氧化作用。

2.3.2銀杏葉黃酮對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化小鼠血清各指標(biāo)的影響

測(cè)定脂質(zhì)過(guò)氧化小鼠血清中MDA含量和SOD活性、T-AOC水平，結(jié)果見(jiàn)表5。

根據(jù)表5可知，血清中抗氧化指標(biāo)中，和四氯化碳組相比，銀杏葉黃酮組MDA量變少，SOD活性、TAOC顯著地提高（P＜0.05），能夠得出銀杏葉黃酮可增強(qiáng)機(jī)體抗氧化的能力，對(duì)CCl4所導(dǎo)致的脂質(zhì)過(guò)氧化能夠起到明顯抑制作用。銀杏葉黃酮組增加SOD活性、T-AOC的效果好于VE組。

表5　銀杏葉黃酮對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化小鼠血清抗氧化指標(biāo)的影響（±s，n=20）Table 5Effect of Ginkgo biloba flavonoids on lipid peroxidation in mouse serum antioxidant（±s，n=20）

表5　銀杏葉黃酮對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化小鼠血清抗氧化指標(biāo)的影響（±s，n=20）Table 5Effect of Ginkgo biloba flavonoids on lipid peroxidation in mouse serum antioxidant（±s，n=20）

注：▲表示與空白對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05）；▲▲表示與空白對(duì)照組比較有極顯著性差異（P＜0.01）；*表示與四氯化碳組比較有顯著性差異（P＜0.05）；**表示與四氯化碳組比較有極顯著性差異（P＜0.01）。

T-AOC/（U/mL）空白對(duì)照組4.56±1.34208.42±16.537.01±3.81四氯化碳組6.75±2.01▲▲218.06±14.438.76±4.65銀杏葉黃酮組953.98±1.96*241.11±26.85*24.13±18.24*VE組951.28±0.20**232.54±31.2122.64±14.31*組別劑量/（mg/kg）MDA含量/（nmol/mg）SOD活性/（U/mL）

3　結(jié)論

超聲波輔助提取銀杏葉黃酮各因素對(duì)銀杏葉黃酮得率的影響大小依次是提取時(shí)間＞提取功率＞提取溫度＞料液比。最佳工藝條件為：提取功率80 W，提取時(shí)間40 min，提取溫度70℃，料液比1∶25（g/mL），在此條件下銀杏葉黃酮得率為27.32 mg/g。銀杏葉黃酮組小鼠肝組織中MDA含量，能提高模型組小鼠肝組織中的T-AOC水平，表明銀杏葉黃酮可增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力。銀杏葉黃酮提高SOD活性、T-AOC水平的效果優(yōu)于VE組。因此，銀杏葉黃酮具有較好的抗氧化作用。

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Study on the Ultrasonic Assisted Extraction of Flavonoids from Ginkgo biloba and Its Anti-oxidation Effect in vitro

FANG Lei
（Jilin Agriculture Science and Technology College，Jilin 132101，Jilin，China）

Ultrasonic assisted extraction flavonoids of Ginkgo biloba and anti-oxidation effect in vitro.Singlefactor and orthogonal experiment to optimize ultrasonic assisted extraction flavonoids process，the effect of Ginkgo biloba flavonoids MDA and T-AOC of liver tissue.The results showed：the best technology：extraction power 80 W，extraction time 40min，extraction temperature 70℃，solid-liquid ratio 1∶25（g/mL），under this condition flavonoids was 27.32 mg/g.Ginkgo biloba flavonoids can significantly reduce the content of MDA in liver tissue（P＜0.05），and improve the mouse liver tissue T-AOC level，indicated that Ginkgo biloba flavonoids can enhance the organism anti-oxidation capacity.

Ginkgo biloba；flavonoids；ultrasonic assisted extraction；anti-oxidation

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.17.038

2016-02-01

房磊（1983—），男（漢），講師，碩士，研究方向：體育運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)保健。