景春娥，李萍，杜欣軍，王碩

（天津科技大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457）

鹽酸小檗堿對(duì)體外阪崎克羅諾桿菌生物膜的抑制作用

景春娥，李萍，杜欣軍，王碩*

（天津科技大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457）

阪崎克羅諾桿菌是食源性條件致病菌，它能夠在食品生產(chǎn)環(huán)境以及設(shè)備表面形成生物膜，從而成為食品的潛在污染源。本研究探討了鹽酸小檗堿對(duì)阪崎克羅諾桿菌生物膜的抑制作用，旨在從中藥來(lái)源中尋找可以控制阪崎克羅諾桿菌生物膜的抗菌物質(zhì)。采用XTT法評(píng)價(jià)了鹽酸小檗堿對(duì)阪崎克羅諾桿菌粘附能力及其生物膜形成的影響。鹽酸小檗堿對(duì)阪崎克羅諾桿菌的抑制效果表現(xiàn)出了劑量依賴(lài)性，MIC90值為512μg/mL。濃度為1024μg/mL的鹽酸小檗堿能夠通過(guò)降低阪崎克羅諾桿菌的粘附能力從而顯著抑制生物膜的形成，并且可以部分清除阪崎克羅諾桿菌成熟的生物膜。因此，鹽酸小檗堿對(duì)于預(yù)防控制阪崎克羅諾桿菌生物膜的形成以及由生物膜導(dǎo)致的臨床感染具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

阪崎克羅諾桿菌；生物膜；鹽酸小檗堿

阪崎克羅諾桿菌（Cronobacter sakazakii）屬于腸桿菌科克羅諾桿菌屬，革蘭氏陰性桿菌［1］，是食源性條件致病菌，它能夠感染不同年齡段的人群，主要導(dǎo)致早產(chǎn)兒或嬰幼兒以及免疫功能低下的成年人患?。?-3］。研究表明，這一致病菌廣泛存在于土壤、水和植物原料（如小麥、大米、藥草和香料等等）［4-5］，具有生存溫度范圍廣［6］和生物膜形成能力強(qiáng)的特點(diǎn)［7］。由于阪崎克羅諾桿菌在惰性表面容易形成生物膜，因此使用熱水或消毒殺菌劑無(wú)法將其徹底清除［8］，導(dǎo)致這一致病菌成為食品加工過(guò)程中重要的污染源。最近一些研究發(fā)現(xiàn)，從食品中分離的阪崎克羅諾桿菌菌株已經(jīng)對(duì)一些抗生素或殺菌劑表現(xiàn)出了不同程度的抗性［9］?？股啬退幮?，是一個(gè)公共健康問(wèn)題，因?yàn)樗赡軐?dǎo)致常規(guī)治療的失敗，從而引起長(zhǎng)期的慢性疾病。

小檗堿是一種異喹啉類(lèi)生物堿，來(lái)自于黃連等植物的根和皮［10-11］。由于小檗堿是帶正電的藥物，易和帶負(fù)電荷的離子或分子結(jié)合，常以氯酸鹽或硫酸鹽的形式存在［12］。臨床中將鹽酸小檗堿（berberine hydrochloride）作為常規(guī)治療藥物的主要成分，具有抗腫瘤［13］抗病毒［14］、抗菌［15-16］等多種藥理活性。此外，有研究報(bào)道，鹽酸小檗堿在抑制表皮葡萄球菌生物膜中發(fā)揮著重要的作用［17-18］。但是，目前對(duì)于使用鹽酸小檗堿抑制阪崎克羅諾桿菌生物膜形成的報(bào)道很少，因此，本研究采用了微孔板法體外建立阪崎克羅諾桿菌生物膜模型，初步探究了鹽酸小檗堿對(duì)阪崎克羅諾桿菌生物膜的抑制作用，為中藥預(yù)防和控制阪崎克羅諾桿菌生物膜相關(guān)感染提供科學(xué)指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株

C.sakazakii ATCC BAA-894購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心，為已經(jīng)測(cè)序菌株；C.sakazakii IQCC10423購(gòu)自工業(yè)微生物菌種保藏中心，是從不同阪崎克羅諾桿菌中篩選到的生物膜形成能力較強(qiáng)的菌株。

1.1.2藥品與試劑

LB培養(yǎng)基：Luria-Bertani；PBS（pH7.4）（NaCl8g/L，KCl 0.2 g/L，Na2HPO41.44 g/L，KH2PO40.24 g/L）；鹽酸小檗堿：中國(guó)食品藥品檢定研究院，110713-201212；二甲基亞砜（DMSO）：Sigma公司；XTT（2，3-Bis（2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl）-2H-tetrazolium-5-carboxanilide inner salt）、乳酸鈉（L-Lactic acidsodium salt）、甲萘醌（Menadione）、多利培南（Doripenem）：購(gòu)自Sigma公司。藥物母液配制：鹽酸小檗堿用二甲基亞砜溶解為6.4 mg/mL的藥物母液，多利培南用0.85%生理鹽水溶解為6.4 mg/mL的藥物母液置-20℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀（Multiskan spectrum）購(gòu)自Thermo公司；96孔微量培養(yǎng)板購(gòu)自Corning公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌懸液的制備

按照1%的接種量將休止細(xì)菌懸液于液體LB培養(yǎng)基中，于37℃恒溫振蕩培養(yǎng)（150 r/min）過(guò)夜；再次按1%的接種量轉(zhuǎn)接后同樣條件培養(yǎng)2 h，菌液在600 nm處測(cè)OD值，并將其調(diào)至0.1用于后續(xù)試驗(yàn)。當(dāng)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)時(shí)，根據(jù)藥敏反應(yīng)液終濃度，菌液稀釋調(diào)整為1×105CFU/mL～5×105CFU/mL，直接加入藥敏板。

1.2.2藥敏反應(yīng)板的制備

參照文獻(xiàn)［19-20］，采用倍比稀釋法，取無(wú)菌96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于每排1號(hào)孔加LB液體培養(yǎng)基100 μL作空白對(duì)照；2號(hào)孔分別加菌液和受試化合物溶液混合液200 μL；12號(hào)孔陰性對(duì)照孔不含藥物，只加菌液100 μL作陽(yáng)性生長(zhǎng)對(duì)照。3-11號(hào)孔各加新鮮配制的菌液100 μL；2-11號(hào)孔進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)垢骺椎淖罱K藥物濃度分別為2048、1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL，各孔中DMSO含量均低于1%，各藥敏板于37℃恒溫箱培養(yǎng)。

1.2.3阪崎克羅諾桿菌最低抑菌濃度（MIC90值）的判定

參照文獻(xiàn)［19-20］測(cè)定阪崎克羅諾桿菌最低抑菌濃度（MIC90值）。將配制好的藥敏反應(yīng)板于37℃恒溫箱中，培養(yǎng)24 h，用酶標(biāo)儀波長(zhǎng)600 nm處測(cè)OD值。與陰性對(duì)照孔相比（只有菌生長(zhǎng)不含藥液），以O(shè)D值下降90%以上的最低濃度孔中的藥物濃度為MIC90（細(xì)菌生長(zhǎng)90%被抑制時(shí)的藥物濃度）。當(dāng)藥物的MIC90值超過(guò)測(cè)定濃度范圍時(shí)，按以下方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，MIC90值為最低濃度或在最低濃度以下時(shí)，不作區(qū)別，均計(jì)為“≤0.125 μg/mL”。上述實(shí)驗(yàn)均平行操作3次，當(dāng)MIC90值能準(zhǔn)確重復(fù)或只差一個(gè)濃度時(shí)為止，并以較高濃度作為MIC90值。

1.2.4XTT法（XTT-reduction assay）

參照文獻(xiàn)［20］將XTT以飽和溶液的形式0.5 g/L保存在乳酸鹽林格液中，用0.22 μm的濾膜過(guò)濾除菌，分裝，-70℃保存；甲萘醌以100 mmol/L溶解于DMSO中，-20℃保存。在每次使用之前，取出凍存的XTT與甲萘醌，常溫自然溶解。XTT-甲萘醌混合溶液中XTT終濃度為0.5 mg/mL，甲萘醌終濃度為1 mmol/L。將100 μL配制好的XTT-甲萘醌溶液加入用PBS洗過(guò)的生物膜生長(zhǎng)孔和對(duì)照孔中。將藥敏培養(yǎng)板于37℃避光培養(yǎng)90 min，用酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸收度值。

1.2.5不同濃度鹽酸小檗堿對(duì)阪崎克羅諾桿菌生物膜的作用分析

將菌懸液，接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)1h，棄去上清，加入用新鮮的LB培養(yǎng)基配制的濃度為0、256、512、1 024、2 048 μg/mL的鹽酸小檗堿，另設(shè)空白對(duì)照孔（只加培養(yǎng)基）與陰性對(duì)照孔（未加藥的生物膜生長(zhǎng)對(duì)照），37℃培養(yǎng)，24 h形成生物膜后，用PBS洗去未粘附細(xì)菌，加入XTT-甲萘醌溶液，將培養(yǎng)板37℃避光培養(yǎng)90 min，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸收度值。

1.2.6鹽酸小檗堿的加入時(shí)間對(duì)阪崎克羅諾桿菌生物膜影響

預(yù)粘附階段不加鹽酸小檗堿：將菌懸液，接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)1 h，棄去上清，PBS清洗，加入新鮮液體LB培養(yǎng)基，37℃分別培養(yǎng)0、1、3、5、7、12、24 h后，棄去上清，加入濃度為1 024 μg/mL的鹽酸小檗堿（用新鮮液體LB培養(yǎng)基配制），另設(shè)空白對(duì)照孔（只加培養(yǎng)基）與陰性對(duì)照孔（未加藥的生物膜生長(zhǎng)對(duì)照），24 h后XTT法測(cè)定生物膜的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)。

預(yù)粘附階段加入鹽酸小檗堿：將濃度為1024μg/mL的鹽酸小檗堿和菌懸液同時(shí)接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)1 h，棄去上清，PBS清洗，加入新鮮液體LB培養(yǎng)基，37℃分別培養(yǎng)0、1、3、5、7、12、24 h后，棄去上清，加入濃度為1 024 μg/mL的鹽酸小檗堿，設(shè)空白對(duì)照孔（只加培養(yǎng)基）與陰性對(duì)照孔（未加藥的生物膜生長(zhǎng)對(duì)照）24 h后XTT法測(cè)定生物膜的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0 for Windows軟件處理，對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1鹽酸小檗堿對(duì)阪崎克羅諾桿菌的MIC90

鹽酸小檗堿對(duì)阪崎克羅諾桿菌BAA-894和IQCC10423的MIC90值為512 μg/mL，見(jiàn)圖1，多利培南對(duì)阪崎克羅諾桿菌MIC90值為0.25 μg/mL。

圖1　不同濃度鹽酸小檗堿對(duì)阪崎克羅諾桿菌的抑制Fig.1Inhibition effect on C.sakazakii by different concentrations of berberine hydrochloride

2.2不同濃度鹽酸小檗堿對(duì)阪崎克羅諾桿菌生物膜形成的影響

將不同濃度的鹽酸小檗堿處理阪崎克羅諾桿菌BAA-894和IQCC10423，24 h后XTT法測(cè)定生物膜的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，結(jié)果表明，512 μg/mL至2048 μg/mL的鹽酸小檗堿對(duì)阪崎克羅諾桿菌BAA-894和IQCC10423生物膜的抑制率分別達(dá)到90%和80%，見(jiàn)圖2和圖3。

圖2　不同濃度鹽酸小檗堿對(duì)阪崎克羅諾桿菌BAA-894生物膜的影響Fig.2Effect of berberine hydrochloride at different concentrations on C.sakazakii BAA-894 biofilm formation

圖3　不同濃度鹽酸小檗堿對(duì)阪崎克羅諾桿菌IQCC10423生物膜的影響Fig.3Effect of berberine hydrochloride at different concentrations on C.sakazakii IQCC10423 biofilm formation

2.3鹽酸小檗堿對(duì)阪崎克羅諾桿菌粘附功能及其生物膜發(fā)展的影響

在阪崎克羅諾桿菌BAA-894和IQCC10423起始粘附1 h后，將1024 μg/mL鹽酸小檗堿加入生物膜形成的不同階段（0、1、3、5、7、12、24 h），24 h后XTT法測(cè)定生物膜的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)。結(jié)果表明，3h加入鹽酸小檗堿后對(duì)兩個(gè)菌株生物膜形成的抑制率分別達(dá)到90.2%和78.1%，0 h時(shí)，對(duì)兩個(gè)菌株生物膜形成的抑制率分別為92.2%和86.6%。24 h時(shí)，對(duì)兩個(gè)菌株生物膜的抑制率分別為53.7%和47.6%。另一方面，起始粘附期間將1 024 μg/mL鹽酸小檗堿分別與BAA-894和IQCC10423共孵育1 h后，能夠降低菌株的粘附能力，7 h前加入鹽酸小檗堿可明顯抑制兩個(gè)菌株生物膜的形成能力，抑制率分別達(dá)到93%和92.5%，0 h時(shí)，對(duì)兩個(gè)菌株生物膜形成的抑制率分別為93.8%和93.4%。24 h時(shí)，對(duì)兩個(gè)菌株生物膜的抑制率分別為67.4%和59.2%，見(jiàn)圖4和圖5。

圖4　鹽酸小檗堿加入的不同時(shí)間對(duì)阪崎克羅諾桿菌BAA-894生物膜形成的影響Fig.4Effects of different addition time of berberine hydrochloride on C.sakazakii BAA-894 biofilm formation

圖5　鹽酸小檗堿加入的不同時(shí)間對(duì)阪崎克羅諾桿菌IQCC10423生物膜形成的影響Fig.5Effects of different addition time of berberine hydrochloride on C.sakazakii IQCC10423 biofilm formation

3　討論

鹽酸小檗堿是一種異喹啉類(lèi)生物堿，對(duì)多種細(xì)菌具有較強(qiáng)的抑制作用［15-18］。Wang等［18］的研究發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿的濃度為15 μg/mL～30 μg/mL時(shí)，能夠抑制表皮葡萄球菌的代謝活性，當(dāng)濃度為30 μg/mL～45 μg/mL時(shí)，能夠抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成。Kim等［22］在研究中發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿對(duì)金黃色葡萄球菌表面蛋白質(zhì)SortaseA的抑制效果明顯，并且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的MIC為50 μg/mL～400 μg/mL。廖璞等［17］的研究發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿可以有效減弱表皮葡萄球菌生物被膜的形成。但是，目前對(duì)于使用鹽酸小檗堿抑制阪崎克羅諾桿菌生物膜形成的研究鮮有報(bào)道。

本試驗(yàn)中采用多利培南作為陽(yáng)性對(duì)照，證明試驗(yàn)方法的有效性。由于多利培南是碳青酶烯類(lèi)新廣譜抗生素，對(duì)腸桿菌科細(xì)菌具有較好的殺滅作用，Mendes等［21］的研究表明多利培南濃度為0.5 μg/mL時(shí)，能抑制98.7%的腸桿菌科分離菌株，并且對(duì)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和AmpC基因介導(dǎo)的β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生菌株抑制率分別達(dá)到了94.3%和93.7%。因此，多利培南對(duì)于腸桿菌科的抗藥性細(xì)菌引起的感染疾病的治療是有臨床應(yīng)用價(jià)值的。多利培南對(duì)阪崎克羅諾桿菌MIC90值為0.25 μg/mL，鹽酸小檗堿對(duì)阪崎克羅諾桿菌BAA-894和IQCC10423的MIC90值為512 μg/mL。

試驗(yàn)中采用的XTT法，不會(huì)損害細(xì)菌生物膜的結(jié)構(gòu)，并且能檢測(cè)出生物膜中細(xì)菌細(xì)胞的代謝活性。由于以前的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明阪崎克羅諾桿菌IQCC10423比ATCC BAA-894的生物膜形成能力強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明前者對(duì)藥物的耐受性比后者強(qiáng)。鹽酸小檗堿濃度為1 024 μg/mL時(shí)對(duì)阪崎克羅諾桿菌BAA-894生物膜的抑制率為92.2%，而對(duì)IQCC10423生物膜抑制率為86.6%。這一結(jié)果表明，菌株的生物膜形成能力與其對(duì)藥物的抗性具有正相關(guān)性。

在阪崎克羅諾桿菌粘附功能及其生物膜形成的測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，加入1 024 μg/mL鹽酸小檗堿的時(shí)間階段不同，對(duì)阪崎克羅諾桿菌生物膜的抑制率不同。3 h前，加入鹽酸小檗堿可明顯抑制生物膜的形成，隨著阪崎克羅諾桿菌生物膜的成熟，在24小時(shí)時(shí)鹽酸小檗堿對(duì)BAA-894和IQCC10423生物膜的抑制率明顯下降。此外，1h起始粘附期間，BAA-894和IQCC10423分別與1 024 μg/mL鹽酸小檗堿共孵育后均降低了菌株的粘附能力，從而抑制了后續(xù)生物膜的生長(zhǎng)與成熟。并且濃度為1 024 μg/mL的鹽酸小檗堿對(duì)阪崎克羅諾桿菌成熟的生物膜具有部分清除作用。

此外，從食品中分離的阪崎克羅諾桿菌菌株已經(jīng)對(duì)一些抗生素或殺菌劑表現(xiàn)出了不同程度的抗性［9］。Müller等［23］的研究發(fā)現(xiàn)，阪崎克羅諾桿菌具有編碼β-內(nèi)酰胺酶的基因，從而對(duì)氨芐青霉素和頭孢菌素表現(xiàn)出了耐藥性。由于抗生素的濫用，導(dǎo)致致病菌耐藥性增加，傳統(tǒng)抗菌藥物的局限性日趨顯現(xiàn)，因此，尋找新的抗菌制劑以及研究其抗菌機(jī)理已經(jīng)成為亟待解決的問(wèn)題。李立津等［24］和楊春梅等［25］的研究發(fā)現(xiàn)小檗堿可消除細(xì)菌的耐藥質(zhì)粒。Severina等［26］在研究中發(fā)現(xiàn)小檗堿能夠穿透金葡萄球菌細(xì)胞膜，是一種多藥耐藥泵作用物。由此可知，鹽酸小檗堿具有恢復(fù)細(xì)菌對(duì)其他抑菌藥物的敏感性的能力。由于細(xì)菌生物膜也與抗生素耐藥有關(guān)［27］。因此，鹽酸小檗堿對(duì)阪崎克羅諾桿菌生物膜抑制作用的研究是具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

4　結(jié)論

濃度為1 024 μg/mL的鹽酸小檗堿能夠部分清除阪崎克羅諾桿菌成熟的生物膜，并且能夠通過(guò)降低阪崎克羅諾桿菌的粘附能力而顯著抑制新生物膜的形成。這一結(jié)果表明，鹽酸小檗堿有可能作為抗菌劑用以控制阪崎克羅諾桿菌生物膜，從而減少其在食品加工環(huán)境的污染以及對(duì)人類(lèi)的危害。

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In vitro Activity of Berberine Hydrochloride against Cronobacter sakazakii Biofilms

JING Chun-e，LI Ping，DU Xin-jun，WANG Shuo*
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Cronobacter sakazakii is an emerging pathogen which can form biofilms on the surfaces of equipment and processing environments.The biofilms of C.sakazakii are a potential source of contamination in food.In this study，the effect of berberine to inhibit C.sakazakii biofilm formation was investigated，which can help find antimicrobial substances from Chinese medical herbs to control its biofilms.The effect of berberine hydrochloride on the initial adhesion of C.sakazakii and its biofilm formation was evaluated by XTT reduction assay.The results revealed that the inhibition effect of berberine hydrochloride on C.sakazakii biofilms showed a dose dependent relationship and the MIC90of berberine hydrochloride against C.sakazakii was 512 μg/mL.Berberine hydrochloride at a concentration of 1 024 μg/mL could inhibit the early adherence of C.sakazakii，which suppressed the development of new biofilms.At this concentration，berberine hydrochloride could also partially destroy the mature biofilms.Therefore，berberine hydrochloride showed a great potential in prevention and control of biofilm formation of C.sakazakii and the biofilm-related infections caused by this pathogen.

Cronobactersakazaki；biofilm；berberinehydrochloride

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.17.033

2015-08-21

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863）課題（2012AA101703）

景春娥（1985—），女（漢），博士研究生，研究方向：食品安全與檢測(cè)技術(shù)。

王碩（1969—），男（漢），教授，博士，研究方向：食品安全和免疫學(xué)檢測(cè)。