劉立業(yè)

（吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林132022）

HPLC-ELSD法測(cè)定昆侖雪菊中氨基酸種類

劉立業(yè)

（吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林132022）

為了更好的開發(fā)、利用昆侖雪菊，研究昆侖雪菊中的氨基酸種類，建立一種高效液相色譜法-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（HPLC-ELSD）直接測(cè)定昆侖雪菊中氨基酸種類的分析方法。以PrevailTMC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱、梯度洗脫、漂移管溫度110℃、氮?dú)饬髁?.5 L/min為色譜條件，在40 min內(nèi)完成20種氨基酸的檢測(cè)。該方法能夠簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地測(cè)定昆侖雪菊中未水解氨基酸的種類，同時(shí)為昆侖雪菊中氨基酸的提取提供依據(jù)。

昆侖雪菊；氨基酸；高效液相色譜法；蒸發(fā)光散射

昆侖雪菊，學(xué)名為兩色金雞菊（Coreopsis tinctoria），是菊科金雞菊屬一年生草本植物，主要分布于新疆和田地區(qū)海拔約3 000 m的昆侖山區(qū)，有較豐富的野生資源［1］。長(zhǎng)期以來，昆侖雪菊被和田居民當(dāng)花茶飲用，可治療燥熱煩渴、高血壓、心慌、胃腸不適、食欲不振、痢疾及瘡癤腫毒。是具有廣闊前景和研究?jī)r(jià)值的新品種［2-3］。

昆侖雪菊主要含有黃酮類、氨基酸、揮發(fā)油等成分，此外還含有多糖、皂苷、綠原酸等成分［4］。李芳等［5］報(bào)道了一種昆侖雪菊的深加工產(chǎn)品——沙棘、雪菊保健飲料，并系統(tǒng)的研究了該產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝及產(chǎn)品中有效成分。昆侖雪菊中其他有效成分的研究較為成熟，唯有氨基酸的研究報(bào)道較少。

氨基酸作為人體必需的一種物質(zhì)，廣泛存在于天然產(chǎn)物中。木合布力·阿布力孜［3］等報(bào)道了一種采用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定昆侖雪菊中氨基酸種類及含量的方法。該方法測(cè)定水解后昆侖雪菊中氨基酸的種類及含量，結(jié)果表明昆侖雪菊含有17種氨基酸，氨基酸總量達(dá)10.81%，其中8種為人體必需氨基酸，占氨基酸總量的40.3%。由于測(cè)定過程中，昆侖雪菊經(jīng)過鹽酸水解，測(cè)定結(jié)果與昆侖雪菊實(shí)際使用過程并不完全一致。因此，建立一種測(cè)定昆侖雪菊中未水解氨基酸的方法，準(zhǔn)確測(cè)定出昆侖雪菊中未水解氨基酸的種類，可以更好的為昆侖雪菊的綜合開發(fā)利用服務(wù)。

目前氨基酸的測(cè)定方法主要有分光光度法、氣相色譜法、液相色譜法、毛細(xì)管電泳法及其它方法（近紅外光譜法、化學(xué)發(fā)光法、熒光光譜法）、柱后衍生高效陽離子交換色譜法、柱前衍生反相高效液相色譜法、高效陰離子交換色譜積分脈沖安培檢測(cè)法等［6-7］。隨著分析技術(shù)的發(fā)展，近年來，高效液相色譜法-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（HPLC-ELSD）被應(yīng)用到氨基酸的分析檢測(cè)中［8-10］。本研究采用HPLC-ELSD建立一種昆侖雪菊中氨基酸種類的檢測(cè)方法，為昆侖雪菊的綜合開發(fā)利用提供必要的數(shù)據(jù)支持。

1　儀器與試劑

P1201高效液相色譜儀（蒸發(fā)光散射檢測(cè)器）：大連依利特分析儀器有限公司；FA2004電子天平：上海儀器天平廠；氨基酸對(duì)照品：甘氨酸（Gly）、絲氨酸（Ser）、纈氨酸（Val）、谷氨酰胺（Gln）、蘇氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、谷氨酸（Glu）、甲硫氨酸（Met）、半胱氨酸（Cys）、胱氨酸（Cys-Cys）、脯氨酸（Pro）、賴氨酸（Lys）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg）、天冬氨酸（Asp）、酪氨酸（Tyr）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）：sigma試劑；乙腈（GR）、三氟乙酸、七氟丁酸：aladdin試劑；水為重蒸水；昆侖雪菊：購自新疆和田；732型離子交換樹脂；氨水。

2　方法

2.1氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

精密稱取20種氨基酸對(duì)照品各適量置于同一量瓶中，用0.01 mol/L鹽酸溶解配置成質(zhì)量濃度均為1.0 g/L對(duì)照品混合溶液。

2.2氨基酸樣品溶液的配制

取挑選去雜后的昆侖雪菊10.0 g置具塞三角瓶中，加入500 mL沸水，浸泡10 min，過濾，濾液放冷后過預(yù)先處理的732陽離子交換樹脂柱。待吸附完畢后，用20 BV去離子水洗滌樹脂；用pH9.0氨水洗脫，收集洗脫液，除氨，濃縮，定容，過0.45 μm濾膜，既得氨基酸樣品溶液。

2.3色譜條件

Prevail C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為七氟丁酸∶三氟乙酸∶水=2∶1∶1 000（體積比），梯度洗脫：0～9 min，0%A；9 min～15 min，0%～10%A；15 min～32 min，10%～20%A；32 min～40 min，25%A；流速0.8 mL/min；漂移管溫度110℃；氣體流量2.5 L/min；進(jìn)樣量10 μL。

3　結(jié)果

3.1氨基酸對(duì)照品溶液的測(cè)定

按照2.3中色譜條件，對(duì)配制完成的氨基酸對(duì)照品溶液進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖1所示。

圖1　氨基酸對(duì)照品HPLC-ELSD色譜圖Fig.1Chromatogram of amino acids standard by HPLC-ELSD

由圖1可知，在此色譜條件下，20種常見氨基酸基本能達(dá)到基線分離，色譜圖峰型較好。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果表明，20種氨基酸理論塔板數(shù)均大于11 000，分離度最小的為1.09（Ala、Glu）

3.2昆侖雪菊中未水解氨基酸種類的測(cè)定

按照2.3中色譜條件，對(duì)配制完成的昆侖雪菊未水解氨基酸樣品溶液進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，在昆侖雪菊未水解氨基酸樣品中，共檢測(cè)到14中氨基酸，分別是：甘氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、谷氨酸、胱氨酸、賴氨酸、脯氨酸、精氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。

4　結(jié)論

1）本研究建立了一種高效液相色譜法-蒸發(fā)光散射測(cè)定昆侖雪菊中未水解氨基酸的方法：

圖2　昆侖雪菊中未水解氨基酸HPLC-ELSD色譜圖Fig.2Chromatogram of non hydrolysis amino acids in Coreopsis tinctoria flower by HPLC-ELSD

色譜條件：Prevail C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相A為乙腈；流動(dòng)相B為七氟丁酸∶三氟乙酸∶水=2∶1∶1 000（體積比）；梯度洗脫：0～9 min，0% A；9min～15min，0%～10%A；15min～32min，10%～20% A；32 min～40 min，25%A；流速0.8 mL/min；漂移管溫度110℃；氣體流量2.5 L/min；進(jìn)樣量10 μL。

昆侖雪菊種未水解氨基酸溶液的處理方法：取挑選去雜后的昆侖雪菊10.0 g置具塞三角瓶中，加入500 mL沸水，浸泡10min，過濾，濾液放冷后過預(yù)先處理的732陽離子交換樹脂柱。待吸附完畢后，用20 BV去離子水洗滌樹脂；用pH9.0氨水洗脫，收集洗脫液，除氨，濃縮，定容，過0.45 μm濾膜，既得氨基酸樣品溶液。

該方法可在40 min內(nèi)對(duì)20中常見氨基酸進(jìn)行檢測(cè)。20種常見氨基酸均能達(dá)到基線分離，系統(tǒng)適用性試驗(yàn)符合定性分析要求。

2）采用以上方法對(duì)昆侖雪菊中未水解氨基酸進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)得到昆侖雪菊水浸提物中含有14種氨基酸（甘氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸*、丙氨酸、谷氨酸、胱氨酸、賴氨酸*、脯氨酸、精氨酸、纈氨酸*、異亮氨酸*、亮氨酸*和苯丙氨酸*），其中6種為人體必需氨基酸。

［1］新疆植物志編輯委員會(huì).新疆植物志（第5卷）［M］.烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社，1999：93

［2］杜鵑，吳忠紅.新疆昆侖雪菊總黃酮含量測(cè)定方法研究［J］.食品研究與開發(fā)，2015，36（1）：93-96

［3］木合布力·阿布力孜，張?zhí)m，張敏.昆侖雪菊中氨基酸的含量分析［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，30（4）：431-432

［4］胡正梅，馬清河.昆侖雪菊的研究進(jìn)展［J］.新疆中醫(yī)藥，2014，32（6）：76-78

［5］李芳，孫來華，李春香，等.沙棘、雪菊保健飲料的加工工藝研究［J］.食品研究與開發(fā)，2015，36（14）：45-48

［6］于泓，牟世芬.氨基酸分析方法的研究進(jìn)展［J］.分析化學(xué)，2005，33（3）：398-404

［7］車蘭蘭，李衛(wèi)華，林勤保.氨基酸分析檢測(cè)方法的研究進(jìn)展［J］.氨基酸和生物資源，2011，33（2）：39-42，48

［8］鄢丹，李果.反相高效液相色譜法直接測(cè)定水蛭中14種未衍生氨基酸的含量［J］.分析化學(xué)，2006，34（5）：705-708

［9］白玉靜，高曉燕，張宏桂，等.HPLC-ELSD法測(cè)定清開靈注射液中19種氨基酸含量［J］.中國中藥雜志，2009，34（24）：3301-3303

［10］王玉紅，申克宇，李鵬，等.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法直接檢測(cè)20種未衍生基本氨基酸［J］.色譜，2011，29（9）：908-911

Determination of Amino Acids in Coreopsis tinctoria Flower from Kunlun Mountain by HPLC-ELSD

LIU Li-ye
（College of Chemistry and Pharmaceutical Engineering，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin 132022，Jilin，China）

In order to explore and utilize the Coreopsis tinctoria flower more efficiently，a high performance chromatograph evaporative light-scattering detection method for the determination of amino acids was studied. The assay was conducted on PrevailTMC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）column，gradient elution，and the detection was performed at the temperature of drift tube of 110℃and the nitrogen gas flow rate of 2.5 L/min.Within 40 minutes，20 kinds of amino acids were detected.This method was simple，accurate to direct determination of amino acids in Coreopsis tinctoria flower，which provided information to extract amino acids in Coreopsis tinctoria flower.

Coreopsis tinctoria flower；amino acids；HPLC；ELSD

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.17.028

2015-11-30

吉林化工學(xué)院科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（2013第36號(hào)）

劉立業(yè)（1979—），男（漢），講師，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物分析。