蔣珍菊，王雁，楊巧

（西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川成都610039）

固相萃取-高效液相法測定芝麻油中苯并（a）芘

蔣珍菊，王雁，楊巧

（西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川成都610039）

建立一種快速、高效測定芝麻油中苯并（a）芘的固相萃取-高效液相色譜（SPE-HPLC）方法。樣品前處理采用硅膠固相萃取柱串聯(lián)氧化鋁固相萃取小柱，稀釋液和淋洗液選擇正己烷，洗脫液選擇二氯甲烷，在40℃下氮吹干后，乙腈復(fù)溶后檢測。采用Waters RP C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分離，以乙腈-水（90∶10）作為流動相，用熒光檢測器檢測，外標(biāo)法峰面積定量。結(jié)果表明，苯并（a）芘在1.00 ng/mL～20.00 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r2為0.999 8，檢出限為0.05 μg/kg，定量限為0.16 μg/kg，加標(biāo)回收率達(dá)到92.2%～98.5%。

高效液相；芝麻油；苯并（a）芘

苯并（a）芘（BaP）是一種多環(huán)芳烴，分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示，化學(xué)性能穩(wěn)定，在烹調(diào)過程中不易被破壞，是多環(huán)芳烴類化合物中致癌性最強(qiáng)的一種物質(zhì)，可以通過食物和飲水進(jìn)入人體，人群流行病研究表明，食品中苯并芘含量與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)系，如乳腺癌、肺癌等［1-2］。植物油中含苯并（a）芘的主要原因包括：油料在曬干、煙熏、炒制過程中可產(chǎn)生苯并（a）芘；用溶劑浸出法制油時，所用溶劑中含有多環(huán)芳烴；油受熱溫度過高和時間較長時可生成苯并（a）芘。在標(biāo)準(zhǔn)GB 2762-2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》中規(guī)定了油脂及其制品苯并（a）芘限量值為10 μg/kg［3］。

圖1　苯并（a）芘結(jié)構(gòu)圖Fig.1Structure of benzo（a）pyrene

現(xiàn)有檢測苯并（a）芘的方法有熒光分光光度法［4］、氣相色譜法［5］、高效液相色譜［6］等，其中高效液相色譜-熒光法為常用檢測方法。參考標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22509-2008《動植物油脂苯并（a）芘的測定：反相高效液相色譜法》中檢測動植物油脂中苯并（a）芘的方法［7］，需要先自行處理中性氧化鋁至Ⅳ級活度，再填裝層析柱，對操作者的實(shí)驗(yàn)技能要求較高、溶劑消耗量大、步驟復(fù)雜，難以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性，使得苯并（a）芘的檢測工作實(shí)驗(yàn)室推廣存在一定難度。本試驗(yàn)在前處理過程中改用商業(yè)化苯并（a）芘專用固相萃取柱，優(yōu)化了前處理的條件，使整個前處理過程簡單化，這樣使得并（a）芘的檢測既能保證準(zhǔn)確性和重復(fù)性，又能滿足簡單快捷的要求。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

2695高效液相色譜系統(tǒng)、2475熒光檢測器：Waters；RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：IKA。

甲醇中苯并（a）芘溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（4.95 μg/mL）：購于中國計(jì)量科學(xué)研究院；甲醇、乙腈為色譜純。

Cleanert BAP-3氧化鋁固相萃取小柱（活度為Ⅳ級）、Cleanert Si硅膠固相萃取柱：博納艾杰爾，3cc。

1.2樣品來源

樣品均為隨機(jī)抽取市場上銷售的芝麻油。

1.3色譜條件

色譜柱：Waters RP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

柱溫：30℃；流動相：乙腈+水。

熒光檢測器：發(fā)射波長：406nm，激發(fā)波長：384 nm。

1.4方法

1.4.1流動相體系中乙腈-水比例對苯并（a）芘色譜行為的影響

固定流動相洗脫速度，流動相選擇不同的乙腈-水體積比例，流動相組成Ⅰ：乙腈-水（84∶16）；流動相組成Ⅱ：乙腈-水（88∶12）；流動相組成Ⅲ：乙腈-水（90∶10）；流動相組成Ⅳ：乙腈-水（92∶8）；考察對苯并（a）芘分析效果和出峰時間的影響，確定最佳流動相比例。

1.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

吸取適量的苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)品，配制成1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)液相色譜儀進(jìn)行分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

在按標(biāo)準(zhǔn)方法［7］處理時，選用的是氧化鋁柱作為苯并（a）芘的吸附載體，但是在實(shí)際試驗(yàn)中效果并不理想，雜質(zhì)干擾峰較多，加標(biāo)回收率不高，所以本試驗(yàn)選用Cleanert BAP-3小柱，對樣品進(jìn)行固相萃取的優(yōu)化。針對芝麻油，還會在Cleanert BAP-3小柱前串聯(lián)Cleanert Si硅膠固相萃取柱，來比較優(yōu)化前后的效果。結(jié)果都以樣品加標(biāo)平均回收率為比較依據(jù)，來制定較優(yōu)的前處理?xiàng)l件。

1.4.4加標(biāo)回收試驗(yàn)

以未檢出苯并（a）芘的芝麻油為空白基質(zhì)，分別加入標(biāo)準(zhǔn)溶液40.0 ng，選擇優(yōu)化后的前處理?xiàng)l件操作，氮吹近干后再用流動相定容至2.0 mL，過0.22 μm濾膜后上機(jī)檢測，計(jì)算回收率。

2　結(jié)果與分析

2.1乙腈-水溶液體系對苯并（a）芘色譜行為的影響

為了了解乙腈-水溶液對苯并（a）芘色譜行為的影響，本研究固定流動相洗脫速度，改變乙腈-水的比例，流動相組成Ⅰ：乙腈-水（84∶16）；流動相組成Ⅱ：乙腈-水（88∶12）；流動相組成Ⅲ：乙腈-水（90∶10）；流動相組成Ⅳ：乙腈-水（92∶8），考察對苯并（a）芘色譜行為的影響。結(jié)果表明：在乙腈-水溶液體系中，乙腈-水比例的不同對苯并（a）芘的色譜保留行為有不同程度的影響，其乙腈比例與苯并（a）芘保留因子的相互關(guān)系符合lnk=a+cCB方程［8-10］（其中k是保留因子，CB是流動相中強(qiáng)溶劑的濃度），且具有良好的線性（r2＞0.99）。當(dāng)比例在乙腈-水（90∶10）時，苯并（a）芘在RP C18柱上可得到良好的基線分離，其峰型良好，如圖2所示。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

為了驗(yàn)證苯并（a）芘在乙腈-水（90∶10）溶液流動相體系中的線性關(guān)系，配制了濃度為1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。每個濃度重復(fù)測定5次，試驗(yàn)結(jié)果表明，苯并（a）芘在1.00 ng/mL～20.00 ng/mL內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系（r2＞0.99）；采用在空白基質(zhì)中添加目標(biāo)組分的方法，依據(jù)色譜峰的性噪比（S/N）大于3倍確定檢出限（LOD），S/N大于10倍確定定量限（LOQ），得到目標(biāo)組分的LOD和LOQ分別為0.05 μg/kg和0.16 μg/kg，結(jié)果見表1。

2.3串聯(lián)硅膠固相萃取柱的選擇

考慮到芝麻油樣品含油量比較高，直接用氧化鋁固相萃取小柱處理后的樣液較混濁，容易形成懸浮液。所以本試驗(yàn)選擇在氧化鋁固相萃取小柱前面串聯(lián)硅膠固相萃取柱去油（圖3中的B圖），與沒有串聯(lián)硅膠固相萃取柱（圖3中的A圖）進(jìn)行比較，結(jié)果以苯并（a）芘的回收率為比較依據(jù)。

圖2　苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖Fig.2Standard substance chromatogram of benzo（a）pyrene

表1　苯并（a）芘的保留時間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限Table 1Retention time，standard curve，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of benzo（a）pyrene

結(jié)果顯示：在樣品串聯(lián)硅膠固相萃取柱后，處理后的樣液澄清，不易形成懸浮液，樣液上機(jī)后的色譜圖中雜質(zhì)干擾峰減少，樣品的加標(biāo)回收率高于未串聯(lián)硅膠固相萃取柱，所以以下試驗(yàn)都選擇氧化鋁固相萃取小柱前面串聯(lián)硅膠固相萃取柱，結(jié)果如圖3所示。

2.4固相萃取稀釋液、淋洗液、洗脫液以及加標(biāo)方式的條件優(yōu)化

參考相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和產(chǎn)品資料，在固相萃取步驟，對芝麻油樣品的稀釋液分別選擇正己烷、石油醚和乙醚3種溶劑進(jìn)行比較；淋洗液也相應(yīng)的選擇正己烷、石油醚和乙醚3種溶劑；洗脫液分別選擇正己烷、二氯甲烷、石油醚和乙醚4種溶劑，結(jié)果以苯并（a）芘的回收率為比較依據(jù)。

圖3　串聯(lián)硅膠柱選擇對苯并（a）芘色譜圖的影響Fig.3The effect of selecting silica gel column on the benzo（a）pyrene chromatogram

對于加標(biāo)回收試驗(yàn)，由于標(biāo)準(zhǔn)品是溶于甲醇里的，考慮到與樣品互溶性的問題，比較兩種加標(biāo)方式Ⅰ：將標(biāo)準(zhǔn)品直接加入到樣品里，Ⅱ：將標(biāo)準(zhǔn)品加入容器氮吹干后，樣品加入容器里。

結(jié)果顯示：在固相萃取步驟，樣品的稀釋液和淋洗液選擇正己烷結(jié)果要略好于石油醚和乙醚，洗脫液選擇二氯甲烷結(jié)果要優(yōu)于其它3種溶劑；對于加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)方式Ⅱ明顯優(yōu)于加標(biāo)方式Ⅰ，結(jié)果如圖4所示。

圖4　稀釋液、淋洗液、洗脫液、串聯(lián)硅膠柱以及加標(biāo)方式的選擇對苯并（a）芘平均回收率的影響Fig.4The effect of dilution solution，leaching solution，elution solution，tandem silica gel column and addition standard method on the average recovery rate of benzo（a）pyrene

2.5樣品的測定及加標(biāo)回收

在我們隨機(jī)抽取的20個批次的芝麻油成品中，根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果選用正己烷稀釋樣品，正己烷淋洗，二氯甲烷洗脫后，洗脫液在40℃下氮吹干后，2 mL乙腈定容后，上機(jī)檢測。結(jié)果表明：用硅膠固相萃取柱串聯(lián)固相萃取柱后，雜質(zhì)峰對目標(biāo)峰的干擾明顯少于凈化前。在所檢測的芝麻油樣品中，苯并（a）芘超標(biāo)的有1個樣品，加標(biāo)回收率92.2%～98.5%，符合檢測要求。

3　結(jié)論

本文建立了一種固相萃取-反相高效液相色譜法檢測芝麻油中苯并（a）芘的分析方法，結(jié)果表明：在乙腈-水（90∶10）體系中，乙腈比例對于溶質(zhì)的色譜保留行為具有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)能力，苯并（a）芘得到了良好的基線分離；固相萃取階段，樣品上住后稀釋液和淋洗液選擇正己烷，洗脫液選擇二氯甲烷，效果較好；加標(biāo)實(shí)驗(yàn)中，先將標(biāo)準(zhǔn)品加入容器氮吹干后，樣品再加入容器里后，對試驗(yàn)干擾更??；在氧化鋁固相萃取柱前面串聯(lián)硅膠固相萃取柱可有效去除芝麻油中的復(fù)雜基質(zhì)對目標(biāo)峰的影響。本試驗(yàn)加標(biāo)回收率為92.2%～98.5%，最低檢出量為0.05 μg/kg，滿足國標(biāo)中對植物油中苯并芘的檢測要求。該法樣品預(yù)處理簡單，試劑消耗少、分析時間短，明顯提高了檢測效率，且其準(zhǔn)確性和精密度好，可實(shí)現(xiàn)對苯并（a）芘的凈化與富集，是測定芝麻油中苯并（a）芘含量的理想方法。

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Determination of Benzo（a）Pyrene in Sesame Oil by Solid-phase Extraction Coupled with High Performance Liquid Chromatography

JIANG Zhen-ju，WANG Yan，YANG Qiao
（School of Food and Bioengineering，Xihua University，Chengdu 610039，Sichuan，China）

A rapid and effective method was established for the determination of benzo（a）pyrene in sesame oil by solid－phase extraction coupled with high performance liquid chromatography（SPE-HPLC）.The samples were treated by silica gel SPE tandem alumina solid-phase extraction column，and the leaching solution of nhexane，the eluent of dichloromethane.The elution liquid was dried at 40℃under nitrogen，and detected after re-dissolution with acetonitrile.The separation of targeted compound was performed on a Waters RP C18 chromatographic column（4.6 mm×250 mm，5 μm）using acetonitrile-water（90∶10）as mobile phase，with fluorescence detector and external standard method peak area quantification.The linear range of benzo（a）pyrene was in the range of 1.00 ng/mL-20.00 ng/mL with a correlation coefficient of 0.999 8.The detection limit was 0.05 μg/kg and the quantitative limit was 0.16 μg/kg.The recovery rate was 92.2%-98.5%.

high performance liquid chromatography（HPLC）；sesame oil；benzo（a）pyrene

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.17.026

2016-06-03

教育部春暉計(jì)劃（Z2015116）；四川省三創(chuàng)項(xiàng)目資助（201510623086）

蔣珍菊（1974—），女（漢），教授，博士，研究方向：應(yīng)用化學(xué)、食品質(zhì)量與安全。