蔣珍菊,王雁,楊巧
(西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,四川成都610039)
固相萃取-高效液相法測定芝麻油中苯并(a)芘
蔣珍菊,王雁,楊巧
(西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,四川成都610039)
建立一種快速、高效測定芝麻油中苯并(a)芘的固相萃取-高效液相色譜(SPE-HPLC)方法。樣品前處理采用硅膠固相萃取柱串聯(lián)氧化鋁固相萃取小柱,稀釋液和淋洗液選擇正己烷,洗脫液選擇二氯甲烷,在40℃下氮吹干后,乙腈復(fù)溶后檢測。采用Waters RP C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)分離,以乙腈-水(90∶10)作為流動相,用熒光檢測器檢測,外標(biāo)法峰面積定量。結(jié)果表明,苯并(a)芘在1.00 ng/mL~20.00 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)r2為0.999 8,檢出限為0.05 μg/kg,定量限為0.16 μg/kg,加標(biāo)回收率達(dá)到92.2%~98.5%。
高效液相;芝麻油;苯并(a)芘
苯并(a)芘(BaP)是一種多環(huán)芳烴,分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示,化學(xué)性能穩(wěn)定,在烹調(diào)過程中不易被破壞,是多環(huán)芳烴類化合物中致癌性最強(qiáng)的一種物質(zhì),可以通過食物和飲水進(jìn)入人體,人群流行病研究表明,食品中苯并芘含量與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)系,如乳腺癌、肺癌等[1-2]。植物油中含苯并(a)芘的主要原因包括:油料在曬干、煙熏、炒制過程中可產(chǎn)生苯并(a)芘;用溶劑浸出法制油時,所用溶劑中含有多環(huán)芳烴;油受熱溫度過高和時間較長時可生成苯并(a)芘。在標(biāo)準(zhǔn)GB 2762-2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》中規(guī)定了油脂及其制品苯并(a)芘限量值為10 μg/kg[3]。
圖1 苯并(a)芘結(jié)構(gòu)圖Fig.1Structure of benzo(a)pyrene
現(xiàn)有檢測苯并(a)芘的方法有熒光分光光度法[4]、氣相色譜法[5]、高效液相色譜[6]等,其中高效液相色譜-熒光法為常用檢測方法。參考標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22509-2008《動植物油脂苯并(a)芘的測定:反相高效液相色譜法》中檢測動植物油脂中苯并(a)芘的方法[7],需要先自行處理中性氧化鋁至Ⅳ級活度,再填裝層析柱,對操作者的實(shí)驗(yàn)技能要求較高、溶劑消耗量大、步驟復(fù)雜,難以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性,使得苯并(a)芘的檢測工作實(shí)驗(yàn)室推廣存在一定難度。本試驗(yàn)在前處理過程中改用商業(yè)化苯并(a)芘專用固相萃取柱,優(yōu)化了前處理的條件,使整個前處理過程簡單化,這樣使得并(a)芘的檢測既能保證準(zhǔn)確性和重復(fù)性,又能滿足簡單快捷的要求。
1.1儀器與試劑
2695高效液相色譜系統(tǒng)、2475熒光檢測器:Waters;RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:IKA。
甲醇中苯并(a)芘溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(4.95 μg/mL):購于中國計(jì)量科學(xué)研究院;甲醇、乙腈為色譜純。
Cleanert BAP-3氧化鋁固相萃取小柱(活度為Ⅳ級)、Cleanert Si硅膠固相萃取柱:博納艾杰爾,3cc。
1.2樣品來源
樣品均為隨機(jī)抽取市場上銷售的芝麻油。
1.3色譜條件
色譜柱:Waters RP C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL。
柱溫:30℃;流動相:乙腈+水。
熒光檢測器:發(fā)射波長:406nm,激發(fā)波長:384 nm。
1.4方法
1.4.1流動相體系中乙腈-水比例對苯并(a)芘色譜行為的影響
固定流動相洗脫速度,流動相選擇不同的乙腈-水體積比例,流動相組成Ⅰ:乙腈-水(84∶16);流動相組成Ⅱ:乙腈-水(88∶12);流動相組成Ⅲ:乙腈-水(90∶10);流動相組成Ⅳ:乙腈-水(92∶8);考察對苯并(a)芘分析效果和出峰時間的影響,確定最佳流動相比例。
1.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
吸取適量的苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)品,配制成1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)液相色譜儀進(jìn)行分析,以峰面積為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.4.3樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化
在按標(biāo)準(zhǔn)方法[7]處理時,選用的是氧化鋁柱作為苯并(a)芘的吸附載體,但是在實(shí)際試驗(yàn)中效果并不理想,雜質(zhì)干擾峰較多,加標(biāo)回收率不高,所以本試驗(yàn)選用Cleanert BAP-3小柱,對樣品進(jìn)行固相萃取的優(yōu)化。針對芝麻油,還會在Cleanert BAP-3小柱前串聯(lián)Cleanert Si硅膠固相萃取柱,來比較優(yōu)化前后的效果。結(jié)果都以樣品加標(biāo)平均回收率為比較依據(jù),來制定較優(yōu)的前處理?xiàng)l件。
1.4.4加標(biāo)回收試驗(yàn)
以未檢出苯并(a)芘的芝麻油為空白基質(zhì),分別加入標(biāo)準(zhǔn)溶液40.0 ng,選擇優(yōu)化后的前處理?xiàng)l件操作,氮吹近干后再用流動相定容至2.0 mL,過0.22 μm濾膜后上機(jī)檢測,計(jì)算回收率。
2.1乙腈-水溶液體系對苯并(a)芘色譜行為的影響
為了了解乙腈-水溶液對苯并(a)芘色譜行為的影響,本研究固定流動相洗脫速度,改變乙腈-水的比例,流動相組成Ⅰ:乙腈-水(84∶16);流動相組成Ⅱ:乙腈-水(88∶12);流動相組成Ⅲ:乙腈-水(90∶10);流動相組成Ⅳ:乙腈-水(92∶8),考察對苯并(a)芘色譜行為的影響。結(jié)果表明:在乙腈-水溶液體系中,乙腈-水比例的不同對苯并(a)芘的色譜保留行為有不同程度的影響,其乙腈比例與苯并(a)芘保留因子的相互關(guān)系符合lnk=a+cCB方程[8-10](其中k是保留因子,CB是流動相中強(qiáng)溶劑的濃度),且具有良好的線性(r2>0.99)。當(dāng)比例在乙腈-水(90∶10)時,苯并(a)芘在RP C18柱上可得到良好的基線分離,其峰型良好,如圖2所示。
2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限
為了驗(yàn)證苯并(a)芘在乙腈-水(90∶10)溶液流動相體系中的線性關(guān)系,配制了濃度為1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。每個濃度重復(fù)測定5次,試驗(yàn)結(jié)果表明,苯并(a)芘在1.00 ng/mL~20.00 ng/mL內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系(r2>0.99);采用在空白基質(zhì)中添加目標(biāo)組分的方法,依據(jù)色譜峰的性噪比(S/N)大于3倍確定檢出限(LOD),S/N大于10倍確定定量限(LOQ),得到目標(biāo)組分的LOD和LOQ分別為0.05 μg/kg和0.16 μg/kg,結(jié)果見表1。
2.3串聯(lián)硅膠固相萃取柱的選擇
考慮到芝麻油樣品含油量比較高,直接用氧化鋁固相萃取小柱處理后的樣液較混濁,容易形成懸浮液。所以本試驗(yàn)選擇在氧化鋁固相萃取小柱前面串聯(lián)硅膠固相萃取柱去油(圖3中的B圖),與沒有串聯(lián)硅膠固相萃取柱(圖3中的A圖)進(jìn)行比較,結(jié)果以苯并(a)芘的回收率為比較依據(jù)。
圖2 苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖Fig.2Standard substance chromatogram of benzo(a)pyrene
表1 苯并(a)芘的保留時間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限Table 1Retention time,standard curve,correlation coefficient,detection limit and quantitative limit of benzo(a)pyrene
結(jié)果顯示:在樣品串聯(lián)硅膠固相萃取柱后,處理后的樣液澄清,不易形成懸浮液,樣液上機(jī)后的色譜圖中雜質(zhì)干擾峰減少,樣品的加標(biāo)回收率高于未串聯(lián)硅膠固相萃取柱,所以以下試驗(yàn)都選擇氧化鋁固相萃取小柱前面串聯(lián)硅膠固相萃取柱,結(jié)果如圖3所示。
2.4固相萃取稀釋液、淋洗液、洗脫液以及加標(biāo)方式的條件優(yōu)化
參考相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和產(chǎn)品資料,在固相萃取步驟,對芝麻油樣品的稀釋液分別選擇正己烷、石油醚和乙醚3種溶劑進(jìn)行比較;淋洗液也相應(yīng)的選擇正己烷、石油醚和乙醚3種溶劑;洗脫液分別選擇正己烷、二氯甲烷、石油醚和乙醚4種溶劑,結(jié)果以苯并(a)芘的回收率為比較依據(jù)。
圖3 串聯(lián)硅膠柱選擇對苯并(a)芘色譜圖的影響Fig.3The effect of selecting silica gel column on the benzo(a)pyrene chromatogram
對于加標(biāo)回收試驗(yàn),由于標(biāo)準(zhǔn)品是溶于甲醇里的,考慮到與樣品互溶性的問題,比較兩種加標(biāo)方式Ⅰ:將標(biāo)準(zhǔn)品直接加入到樣品里,Ⅱ:將標(biāo)準(zhǔn)品加入容器氮吹干后,樣品加入容器里。
結(jié)果顯示:在固相萃取步驟,樣品的稀釋液和淋洗液選擇正己烷結(jié)果要略好于石油醚和乙醚,洗脫液選擇二氯甲烷結(jié)果要優(yōu)于其它3種溶劑;對于加標(biāo)回收試驗(yàn),加標(biāo)方式Ⅱ明顯優(yōu)于加標(biāo)方式Ⅰ,結(jié)果如圖4所示。
圖4 稀釋液、淋洗液、洗脫液、串聯(lián)硅膠柱以及加標(biāo)方式的選擇對苯并(a)芘平均回收率的影響Fig.4The effect of dilution solution,leaching solution,elution solution,tandem silica gel column and addition standard method on the average recovery rate of benzo(a)pyrene
2.5樣品的測定及加標(biāo)回收
在我們隨機(jī)抽取的20個批次的芝麻油成品中,根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果選用正己烷稀釋樣品,正己烷淋洗,二氯甲烷洗脫后,洗脫液在40℃下氮吹干后,2 mL乙腈定容后,上機(jī)檢測。結(jié)果表明:用硅膠固相萃取柱串聯(lián)固相萃取柱后,雜質(zhì)峰對目標(biāo)峰的干擾明顯少于凈化前。在所檢測的芝麻油樣品中,苯并(a)芘超標(biāo)的有1個樣品,加標(biāo)回收率92.2%~98.5%,符合檢測要求。
本文建立了一種固相萃取-反相高效液相色譜法檢測芝麻油中苯并(a)芘的分析方法,結(jié)果表明:在乙腈-水(90∶10)體系中,乙腈比例對于溶質(zhì)的色譜保留行為具有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)能力,苯并(a)芘得到了良好的基線分離;固相萃取階段,樣品上住后稀釋液和淋洗液選擇正己烷,洗脫液選擇二氯甲烷,效果較好;加標(biāo)實(shí)驗(yàn)中,先將標(biāo)準(zhǔn)品加入容器氮吹干后,樣品再加入容器里后,對試驗(yàn)干擾更??;在氧化鋁固相萃取柱前面串聯(lián)硅膠固相萃取柱可有效去除芝麻油中的復(fù)雜基質(zhì)對目標(biāo)峰的影響。本試驗(yàn)加標(biāo)回收率為92.2%~98.5%,最低檢出量為0.05 μg/kg,滿足國標(biāo)中對植物油中苯并芘的檢測要求。該法樣品預(yù)處理簡單,試劑消耗少、分析時間短,明顯提高了檢測效率,且其準(zhǔn)確性和精密度好,可實(shí)現(xiàn)對苯并(a)芘的凈化與富集,是測定芝麻油中苯并(a)芘含量的理想方法。
[1]李永紅,金銀龍.苯并(a)芘致癌機(jī)制研究新進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2011,40(8):152-154
[2]葉萌,劉秉慈,杜宏舉,等.苯并芘誘導(dǎo)人胚肺成纖維細(xì)胞cyclin D1,CDK4和E2F-1/4的表達(dá)改變[J].衛(wèi)生研究,2006(2):135-138
[3]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 2762-2012食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2012
[4]中華人民共和國衛(wèi)生部,中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/T 5009.27-2003食品中苯并(a)芘的測定[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2003
[5]張莉,張永濤.固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用快速檢測地下水中13種有機(jī)氯農(nóng)藥及苯并[a]芘[J].分析實(shí)驗(yàn)室,2008,27(S):400-402
[6]劉玉蘭,張小濤,趙歡歡.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測食用油脂中苯并芘[J].農(nóng)業(yè)機(jī)械,2010(10):45-48
[7]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局,中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/T 22509-2008動植物油脂苯并(a)芘的測定:反相高效液相色譜法[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008
[8]JW Dolan,JR Gant,LR Synder.Gardient elution in high performance liquid chromatography:II.partical application to reversed phase systems[J].J Chromatogr,1979,165(1):31-58
[9]鄒漢法,張玉奎,盧佩章.反相離子對色譜法及其應(yīng)用[J].色譜,1992,10(6):329-333
[10]PC Lu,XM Lu.Development of a high performance liquid chromatography with artifical intelligence[J].J Chromatogr,1984,292(1):169-188
Determination of Benzo(a)Pyrene in Sesame Oil by Solid-phase Extraction Coupled with High Performance Liquid Chromatography
JIANG Zhen-ju,WANG Yan,YANG Qiao
(School of Food and Bioengineering,Xihua University,Chengdu 610039,Sichuan,China)
A rapid and effective method was established for the determination of benzo(a)pyrene in sesame oil by solid-phase extraction coupled with high performance liquid chromatography(SPE-HPLC).The samples were treated by silica gel SPE tandem alumina solid-phase extraction column,and the leaching solution of nhexane,the eluent of dichloromethane.The elution liquid was dried at 40℃under nitrogen,and detected after re-dissolution with acetonitrile.The separation of targeted compound was performed on a Waters RP C18 chromatographic column(4.6 mm×250 mm,5 μm)using acetonitrile-water(90∶10)as mobile phase,with fluorescence detector and external standard method peak area quantification.The linear range of benzo(a)pyrene was in the range of 1.00 ng/mL-20.00 ng/mL with a correlation coefficient of 0.999 8.The detection limit was 0.05 μg/kg and the quantitative limit was 0.16 μg/kg.The recovery rate was 92.2%-98.5%.
high performance liquid chromatography(HPLC);sesame oil;benzo(a)pyrene
10.3969/j.issn.1005-6521.2016.17.026
2016-06-03
教育部春暉計(jì)劃(Z2015116);四川省三創(chuàng)項(xiàng)目資助(201510623086)
蔣珍菊(1974—),女(漢),教授,博士,研究方向:應(yīng)用化學(xué)、食品質(zhì)量與安全。