陳亮，辛秀蘭，李曄，王曉杰，馮暉

（北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院，北京100176）

SBC法測(cè)定金花葵黃酮的含量

陳亮，辛秀蘭*，李曄，王曉杰，馮暉

（北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院，北京100176）

對(duì)金花葵植株各部分干花、果、葉、莖及金花葵產(chǎn)品酒、油中總黃酮含量進(jìn)行了研究。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用新方法-硼氫化鈉/氯醌（SBC）比色法對(duì)金花葵各樣品總黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果表明，金花葵植株各部分及產(chǎn)品中總黃酮含量在62.0 mg/g～229.0 mg/g之間，其中金花葵干花總黃酮含量最高，可達(dá)228.19 mg/g，為開發(fā)金花葵產(chǎn)品提供參考。

金花葵；總黃酮；硼氫化鈉/氯醌（SBC）比色法

金花葵（Hibiscus manihot L.）又名菜芙蓉，野芙蓉，為一年生草本錦葵科秋葵屬植物。自然分布在河北、河南地區(qū)，是近瀕臨絕種的植物之一。因其功效漸被人知，目前已經(jīng)有很多金花葵種植基地，多分布在太行山東部山麓地區(qū)，晉中晉南地區(qū)。

金花葵含有豐富的蛋白質(zhì)、游離氨基酸、VC、VA、VE、和磷、鐵、鉀、鈣、鋅、錳等礦質(zhì)元素及由果膠和多糖等組成的粘性物質(zhì)。故金花葵被稱為植物大熊貓［1］。金花葵珍貴之處在于全株無(wú)一處廢物，芽、苗、嫩尖、花蕾、嫩果均可作為新品種特菜供應(yīng)市場(chǎng)，家庭及飯店可炒、過(guò)水涼拌、做湯等，渾素皆宜。此外，它還屬于藥膳同用植物，既可入藥，又是一種很好的營(yíng)養(yǎng)保健品。

金花葵含有極為豐富的黃酮類化合物，是黃酮類化合物提取的較佳原料。黃酮類化合物具有超強(qiáng)的抗氧化能力，在維護(hù)人循環(huán)系統(tǒng)正常功能方面起著特殊作用，可使肌膚保持彈性，消除或抑制皺紋褐色斑的產(chǎn)生。越來(lái)越多的證據(jù)表明，生物類黃酮物質(zhì)通過(guò)清除自由基、保護(hù)細(xì)胞組織，達(dá)到增強(qiáng)人體免疫力?？梢员Ｗo(hù)人體免受自由基氧化導(dǎo)致的心臟病和癌癥等60余種疾病的發(fā)生。其豐富的天然植物雌激素，對(duì)于延長(zhǎng)女性青春期，減輕或避免中老年更年期綜合癥也有奇效。金花葵也含有豐富的金絲桃苷成分，而金絲桃苷具有明顯的抗炎作用，有較強(qiáng)的止咳作用，另外，還具有較強(qiáng)的抑制醛糖還原酶的作用［2-5］。金花葵根莖葉及干花簡(jiǎn)單加工成花草茶或直接提取金花葵生物黃酮，或進(jìn)一步加工成保健品和藥品。

因此，定量測(cè)定金花葵中總黃酮的含量具有重要意義。目前，有三種常用于測(cè)定總黃酮含量的方法：Folin-Ciocalteu（F-C）比色法、亞硝酸鈉-氯化鋁比色法和高效液相色譜法［6-8］。Folin-Ciocalteu（F-C）比色法是最為常見測(cè)定酚類成分的方法之一，廣泛用于測(cè)定果蔬中的總酚含量，但是，它對(duì)于黃酮類成分含量測(cè)定的專一性不強(qiáng)，只要是帶有活性羥基的化合物，如酚酸、黃酮、抗壞血酸、還原糖、還有一些氨基酸和芳香胺類成分，都可測(cè)得。而高效液相色譜法專一性和靈敏度都高于比色法，但是它需要可用的標(biāo)準(zhǔn)品和液相色譜的分離度的要求，限制高效液相色譜法的應(yīng)用。現(xiàn)階段最常用于總黃酮測(cè)定的方法是亞硝酸鈉-氯化鋁比色法，但是測(cè)得的數(shù)據(jù)受限于該方法只能測(cè)定黃酮類成分中的黃酮、黃酮醇等成分，而對(duì)于黃烷酮、黃烷醇、花色素等成分無(wú)法測(cè)定，因此該方法仍具有一定的局限性。

本文采用Xiangjiu He等［9］開發(fā)的一種總黃酮測(cè)定新方法-硼氫化鈉/氯醌（SBC）比色法，避免了亞硝酸鈉-氯化鋁比色法的局限性，方法反應(yīng)機(jī)制如圖1，帶有4-羰基的黃酮類成分，如：黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇和異黃酮類成分，可被硼氫化鈉還原成黃烷-4-醇，該反應(yīng)加入氯化鋁催化可得到很高產(chǎn)量的黃烷-4-醇；黃烷醇類可被乙酸溶液中的氯醌氧化成花色苷類成分?；ㄉ疹惓煞衷偌尤胂悴萑┖蜐恹}酸可在490 nm處用分光光度計(jì)進(jìn)行定量。

圖1　SBC法測(cè)定總黃酮的主要化學(xué)反應(yīng)機(jī)理Fig.1Main chemical reactions of the SBC total flavonoid analysis

本文以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用硼氫化鈉/氯醌（SBC）比色法對(duì)金花葵干花、果、葉、莖、酒和籽油中的總黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定，為進(jìn)一步研究金花葵中有效成分及開發(fā)金花葵產(chǎn)品提供參考。

1　材料

金花葵原材料及產(chǎn)品：均由河南平頂山軍昊農(nóng)業(yè)有限公司提供，生產(chǎn)日期為2015年10月。

金花葵原材料有新鮮金花葵植株不同部位莖、葉、果和干花；金花葵產(chǎn)品有金花葵酒及金花葵籽油。

1.2試劑

硼氫化鈉、氯醌、四氫呋喃、乙醇、三氯化鋁、冰醋酸、鹽酸和香草醛，均為分析純：購(gòu)自北京化工廠。

1.3儀器

9960A超聲提取清洗機(jī)：美國(guó)CBL光電子技術(shù)有限公司；豪威斯AR5120型電子天平：北京天平醫(yī)用廠；Laborato 4000 efficient旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國(guó)海道夫儀器有限公司；日立高速離心機(jī)CR-GIII：天美科學(xué)儀器有限公司；UV-1800紫外分光光度計(jì)：北京彭曼科技有限責(zé)任公司。

1.4方法

1.4.1提取工藝

將金花葵干花、果、葉、莖剪碎，各取剪碎后的金花葵原材料1 g，分別置于燒杯中，按照料液比為1∶35（g/mL），加入60%乙醇水溶液，90℃提取4 h，取提取液經(jīng)真空濃縮至棕色浸膏狀后，再用四氫呋喃-乙醇混合溶液（1∶1，體積比）溶解并定容于25 mL比色管中，3 000 r/min離心15 min，取上清液為樣品，4℃保存?zhèn)溆茫?］。

取適量金花葵酒，經(jīng)真空濃縮至棕色浸膏狀后，再用四氫呋喃-乙醇混合溶液（1∶1，體積比）溶解并定容于25 mL比色管中，3 000 r/min離心15 min，取上清液為樣品，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取適量金花葵籽油直接用四氫呋喃-乙醇混合溶液（1∶1，體積比）溶解并定容于25 mL比色管中，3000r/min離心15min，取上清液為樣品，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2SBC法測(cè)定總黃酮含量［10］

1.4.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

稱取對(duì)照品蘆丁33 mg溶于四氫呋喃-乙醇混合溶液（1∶1，體積比）中，定容至5 mL，蘆丁濃度為6.6 mg/mL，分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL于6個(gè)比色管中，標(biāo)記后依次分別加入1、0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL四氫呋喃-乙醇混合溶液（1∶1，體積比）稀釋搖勻，濃度平均分布在（0.1 mmol/L～10.0 mmol/L）內(nèi)，再分別加入0.2 mL四氫呋喃-乙醇混合溶液（1∶1，體積比），然后加入50 mmol/L的硼氫化鈉0.5 mL和74.6 mmol/L的三氯化鋁0.5 mL，室溫振蕩30 min，分別再次加入5 050 mmol/L硼氫化鈉0.5 mL，室溫振蕩30 min。然后加入2 mL預(yù)冷的0.8 mol/L的冰醋酸，避光振蕩15min。再加入20 mmol/L的氯醌1 mL，加熱至100℃保持1 h，冷卻后加入1 052 mmol/L的香草醛1 mL，混合后加入12 mol/L的鹽酸2 mL，避光振蕩反應(yīng)15 min后進(jìn)行紫外掃描，最大吸收波長(zhǎng)為510 nm［5］。以零管做空白，在510 nm處測(cè)定吸光度，以各管濃度為x軸，以吸光度A為y軸進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為y=1.171 6x+ 0.018 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 4。蘆丁測(cè)定質(zhì)量濃度的線性范圍為0.15 mg/mL～0.76 mg/mL。

圖2　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2The standard curve of rutin

1.4.2.2精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液適量，按照1.4.2.1加入顯色劑，連續(xù)測(cè)定6次，記錄吸光度值A(chǔ)。蘆丁測(cè)定的RSD為0.97%（n=6），表明方法的精密度良好。

1.4.2.3穩(wěn)定性試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液適量，按照1.4.2.1加入顯色劑，反應(yīng)完畢，分別放置0、10、20、30、40、50、60 min進(jìn)行吸光度值測(cè)定，結(jié)果的RSD為1.36%（n=7），表明方法的穩(wěn)定性良好。

1.4.2.4加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量樣品試樣，分別加入一定體積已知濃度對(duì)照品蘆丁溶液，按照1.4.2.1加入顯色劑，反應(yīng)完畢，測(cè)定吸光度值，計(jì)算樣品含量及加樣回收率，結(jié)果方法的平均加樣回收率為97.39%，RSD為2.33%（n=6）。

1.4.2.5樣品含量測(cè)定

分別吸取0.5 mL樣液于比色管中，加入0.5mL四氫呋喃-乙醇混合溶液（1∶1，體積比）與標(biāo)準(zhǔn)溶液體積相同，再加入0.2 mL四氫呋喃-乙醇混合溶液（1∶1，體積比），然后加入50 mmol/L的硼氫化鈉0.5 mL和74.6 mmol/L的三氯化鋁0.5 mL，室溫振蕩30 min，再次分別加入5 050 mmol/L硼氫化鈉0.5 mL，室溫振蕩30 min。再加入2 mL預(yù)冷的0.8 mol/L的冰醋酸，避光振蕩15 min。再加入20 mmol/L的氯醌1 mL，加熱至100℃保持1 h，冷卻后加入1 052 mmol/L的香草醛1 mL，混合后加入12 mol/L的鹽酸2 mL，避光振蕩反應(yīng)15 min后進(jìn)行紫外掃描，最大吸收波長(zhǎng)為510 nm。以零管做空白，在510 nm處測(cè)定樣品溶液的吸光度，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，計(jì)算出金花葵各樣品的總黃酮含量。

2　結(jié)果與討論

本文采用硼氫化鈉/氯醌（SBC）比色法測(cè)定金花葵干花、果、葉、莖、酒、籽油各樣品溶液3次，取平均值，測(cè)定結(jié)果圖3。

圖3　樣品測(cè)定結(jié)果圖Fig.3Results of samples determination

從上圖3中可以看出，經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，金花葵干花的含量為228.0 mg/g，果實(shí)的含量為101.73 mg/g，葉的含量為90.93 mg/g，油的含量為70.77 mg/g，莖的含量為63.82 mg/g，酒的含量為62.26 mg/g。依數(shù)據(jù)可見，金花葵中黃酮含量極高。所測(cè)定的金花葵各部分中總黃酮的含量在62.0 mg/g～228.0 mg/g之間。而黃酮含量最高的是金花葵干花，可達(dá)228.19 mg/g。由此可見，金花葵全身是寶，黃酮含量較高，其中干花含量最高。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)是測(cè)定金花葵干花、果、葉、莖、酒、油里面的總黃酮含量，采取的測(cè)定方法是硼氫化鈉/氯醌（SBC）比色法、紫外分光光度計(jì)法。所測(cè)定的金花葵各部分中總黃酮的含量在62.0 mg/g～228.0 mg/g之間。黃酮含量最高的是金花葵干花，可達(dá)228.19 mg/g。

SBC法是一種新的測(cè)定包括黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇、異黃酮類、黃烷醇（兒茶素）和花色苷等總黃酮的方法，本方法還具有很高的準(zhǔn)確度和精密度，對(duì)黃酮含量的測(cè)定具有專一性，可廣泛用于水果、蔬菜、谷類、保健營(yíng)養(yǎng)品中總黃酮含量的測(cè)定。本文采用SBC法測(cè)定金花葵黃酮含量，以期為金花葵成分及產(chǎn)品的研發(fā)提供參考。

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Determination of Total Flavonoid Contents of Hibiscus manihot L.with SBC Method

CHEN Liang，XIN Xiu-lan*，LI Ye，WANG Xiao-jie，F(xiàn)ENG Hui
（College of Bioengineering，Beijing Polytechnic，Beijing 100176，China）

The total flavonoid contents of the dried flowers，fruits，leaves，stems，wine and oil of Hibiscus manihot L.were studied in this paper.Rutin was used as standard，and the new method-sodium borohydride/chloranilbased（SBC）colorimetric method was employed to determine the contents of total flavonoid in samples of Hibiscus manihot L..The results showed that total flavonoid contents of each plant part and product of Hibiscus manihot L.were among 62.0 mg/g-229.0 mg/g，and the content of total flavonoid of Hibiscus manihot L.flower was highest，up to 228.19 mg/g，which provided reference for Hibiscus manihot L.products development.

Hibiscus manihot L.；total flavonoid contents；sodium borohydride/chloranil-based colorimetry（SBC）

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.17.025

2016-04-13

北京電子科技職業(yè)學(xué)院科技類博士資助課題（YZKB2014005）；北京市教委科技計(jì)劃面上項(xiàng)目（KM201510858001）；北京電子科技職業(yè)學(xué)院科研團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（TD201602）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201103037）

陳亮（1986—），男（漢），講師，博士，研究方向：天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)。

辛秀蘭（1968—），女（漢），教授，博士，研究方向：小漿果資源的研究與推廣。