關(guān)天旺，楊航，劉嘉煜，唐福才，王漫妮，李迅，林錦裕，秦玲玲，吳文浩

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院，廣東廣州510000；2.廣州醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院，廣東廣州510000；3.廣州醫(yī)科大學(xué)金域檢驗(yàn)學(xué)院，廣東廣州510000；4.廣州醫(yī)科大學(xué)第三臨床學(xué)院，廣東廣州510000；5.廣州醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院，廣東廣州510000；6.廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州510000）

龍眼核多酚提取物對(duì)酪氨酸酶抑制作用的研究

關(guān)天旺1，楊航1，劉嘉煜1，唐福才2，王漫妮3，李迅4，林錦裕4，秦玲玲5，吳文浩6，*

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院，廣東廣州510000；2.廣州醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院，廣東廣州510000；3.廣州醫(yī)科大學(xué)金域檢驗(yàn)學(xué)院，廣東廣州510000；4.廣州醫(yī)科大學(xué)第三臨床學(xué)院，廣東廣州510000；5.廣州醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院，廣東廣州510000；6.廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州510000）

研究龍眼核多酚提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用。用龍眼核多酚提取物，分別以L-酪氨酸、L-多巴為底物，在475 nm處測(cè)定溶液吸光度和吸光度的變化，觀察龍眼核多酚對(duì)單酚酶、雙酚酶活性的影響。結(jié)果表明龍眼核多酚對(duì)酪氨酸單酚酶、二酚酶均有抑制作用，半抑制濃度IC50分別為12.68、11.81 mg/mL。龍眼核多酚為酪氨酸酶可逆競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，抑制常數(shù)（KI）為0.538mg/mL。

酪氨酸酶；龍眼核；多酚；抑制作用；酶動(dòng)力學(xué)

酪氨酸酶是一種廣泛存在于生物體內(nèi)、催化黑色素合成的關(guān)鍵限速酶，同時(shí)具有單酚酶和二酚酶活性［1-2］。它與生物體的重要生理過程密切關(guān)系，其過量表達(dá)，既可導(dǎo)致人體色素沉著性疾病如雀斑、黃褐斑、黑色素瘤的形成［3-4］，也可加速果蔬的褐變［5］，此外，還參與昆蟲蛻皮過程的鞣化作用［6］。酪氨酸酶抑制劑可被廣泛用于醫(yī)藥［7］、食品保鮮劑［8］、殺蟲劑等領(lǐng)域。然而，傳統(tǒng)酪氨酸抑制劑多為化學(xué)合成，存在一定的毒副作用，如曲酸長(zhǎng)期接觸可導(dǎo)致皮膚癌、皮炎、細(xì)胞毒性［9］等和對(duì)苯二酚可導(dǎo)致永久脫色［10］。因此，研發(fā)和尋找高效無毒、特異性強(qiáng)的酪氨酸酶抑制劑已成為醫(yī)藥、農(nóng)學(xué)、食品等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

多酚即多羥基苯，廣泛存在于植物及微生物中，對(duì)人體有益［11-12］，具有清除自由基、抗氧化、與金屬離子的絡(luò)合等特性［13］。其可通過清除自由基和絡(luò)合酪氨酸酶活性中心的銅離子，抑制酪氨酸酶活性。國(guó)內(nèi)外研究表明蘋果多酚［14］、柿子葉多酚［15］等多酚對(duì)酪氨酸酶具有抑制能力。多酚具有成為酪氨酸酶抑制劑之一的巨大研發(fā)潛力。

研究表明，龍眼核中具有豐富的多酚類物質(zhì)，抗氧化活性僅次于芒果核多酚［16-17］。本課題組前期試驗(yàn)表明，從龍眼核中提取的多酚類物質(zhì)具有良好體外抗氧化活性，對(duì)羥自由基、DPPH自由基均具有良好清除作用［18］。但目前關(guān)于龍眼核多酚作為酪氨酸酶抑制劑研究的報(bào)道鮮有見到。

本文以“石硤”龍眼核為原料，通過超聲波輔助提取法得到龍眼核多酚提取物，探究其對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用和抑制機(jī)理，為龍眼核多酚作為酪氨酸酶抑制劑的開發(fā)研究，提供前期試驗(yàn)基礎(chǔ)和依據(jù)，為龍眼核的開發(fā)提供新思路。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

“石硤”龍眼核：產(chǎn)地廣州番禺；酚試劑、乙酸乙酯、無水乙醇、二甲基亞礬（DMSO）、沒食子酸（均為分析純）：購(gòu)買于百靈威科技有限公司；磷酸鹽緩沖溶液（0.05 mmol/L，pH=6.8）L-酪氨酸、左旋多巴、蘑菇酪氨酸酶（活力比≥500 U/mg）：均購(gòu)于阿拉丁試劑有限公司；RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鞏儀市予華儀器有限責(zé)任公司；SHZD（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：鞏義市英予華儀器廠；KQ-500VDE型三頻數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；BS-124S電子天平：SartoriusAG Sar torius；DFT-250手提式中藥粉碎機(jī)：貴州三陽包裝設(shè)備有限公司；MK3全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀：芬蘭Thermo公司。

1.2方法

1.2.1超聲波輔助法提取龍眼核多酚［18］

將龍眼核洗凈，置于恒溫干燥箱中，40℃干燥至恒重，將其粉碎并過60目篩。稱取50 g的龍眼核粗粉，以1∶20（g/mL）的料液比，加入75%的乙醇溶液，在溫度60℃條件下，超聲波（功率100%）輔助提取50 min，減壓抽濾得到多酚提取液，等同條件重復(fù)提取濾渣3次，合并濾液，50℃下旋干濃縮至一定體積，再用飽和食鹽水萃取并洗滌3次，加入足量Na2SO4干燥過夜。次日，減壓抽濾取上清液，在50℃下旋干得到多酚浸膏，稱量。

1.2.2多酚含量的測(cè)定

采用Folin-Ciocalteus法［18］測(cè)定多酚含量。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，稱取沒食子酸50 mg，加入蒸餾水定容至500 mL，得到0.1 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液。常溫下，取8支10 mL試管分別加入沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mL，用蒸餾水補(bǔ)足至2 mL，加入福林酚試劑1.0 mL搖勻，靜置4 min，再加入10%碳酸鈉溶液1.0 mL，搖勻后于25℃條件下靜置2 h，在750 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，沒食子酸含量（μg）為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

用DMSO將龍眼核多酚浸膏配制成1mg/mL的樣品液，在750 nm處測(cè)其吸光度，重復(fù)3次。以標(biāo)準(zhǔn)曲線算出樣品濃度，并按公式（1）計(jì)算提取率。

式中：c為樣品的質(zhì)量濃度，mg/mL；v為樣品稀釋后的體積，mL；m為龍眼核粉質(zhì)量，mg。

1.2.3多酚提取物抑制酪氨酸酶活性的測(cè)定

1.2.3.1單酚酶抑制活性測(cè)定

以1mmol/L的L-酪氨酸為底物，先配制50 mg/mL的多酚提取物母液，再用DMSO分別稀釋成為5、10、20、40 mg/mL的樣品溶液。在96孔板中加入總體積為160 μL的反應(yīng)體系，依次加入100 μL的PBS溶液、10 μL的4 mg/L酪氨酸酶、10 μL樣品溶液后25℃孵育10 min，之后迅速加入40 μL的L-酪氨酸，混勻。5 min后，在475 nm吸光度處，用酶標(biāo)儀每隔1 min進(jìn)行吸光度測(cè)定，試驗(yàn)重復(fù)3次。每1 min吸光度的變化值記為ODA1。將10 μL樣品替換成10 μL DMSO，測(cè)定值記為ODB1。樣品對(duì)酪氨酸酶的抑制率的計(jì)算公式為

1.2.3.2二酚酶抑制活性測(cè)定

以7.6 mmol/L的左旋多巴（L-DOPA）為底物，將50 mg/mL多酚提取物母液用DMSO分別稀釋成5、10、20、40 mg/mL的樣品溶液，在96孔板中加入總體積為190 μL的反應(yīng)體系，依次加入150 μL的PBS溶液、5 μL的2 mg/mL酪氨酸酶、5 μL樣品溶液后25℃孵育10min，之后迅速加入30 μL的L-DOPA，混勻。在475 nm吸光度處，立即用酶標(biāo)儀每隔30 s進(jìn)行吸光度測(cè)定，試驗(yàn)重復(fù)3次。每30s吸光度的變化值記為ODA2。將5 μL樣品替換成5 μL DMSO，測(cè)定值記為ODB2。樣品對(duì)酪氨酸酶的抑制率的計(jì)算公式為

1.2.3.3二酚酶抑制活性的動(dòng)力學(xué)分析

按照1.2.3.2的反應(yīng)體系和試驗(yàn)方法，選取多酚提取物濃度為10、20 mg/mL以及空白組3個(gè)系列，改變酪氨酸酶濃度（2、4、5、6 mg/mL）。每隔30 s于475 nm下測(cè)定吸光度，重復(fù)3次試驗(yàn)。用酪氨酸酶濃度對(duì)酶催化活性作圖。

按照1.2.3.2的反應(yīng)體系和試驗(yàn)方法，保持酶質(zhì)量濃度（2 mg/mL）不變，改變底物多巴的含量（最終為0.6 mmol/L～2.4 mmol/L），于475 nm處測(cè)定吸光度的變化值，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖，通過米氏常數(shù)Km和酶促反應(yīng)最大速率vm的變化來判斷抑制類型。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用方差分析（ANOVA）和t檢驗(yàn)，顯著性水平為P＜0.05，極顯著性水平為P＜0.01。

2　結(jié)果與分析

2.1龍眼核多酚提取物的得率與多酚含量

按1.2.2的方法制作沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=10.024x-0.662 7，R2=0.999 2，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。提取得率為1.435%，1 g龍眼核粉提取的多酚質(zhì)量為14.35 mg。

2.2龍眼核多酚提取物對(duì)酪氨酸酶抑制活性的影響

2.2.1多酚提取物對(duì)酪氨酸酶單酚酶抑制活性的影響

龍眼核多酚提取物對(duì)酪氨酸酶活性抑制率的量效關(guān)系見圖1。

圖1　對(duì)單酚酶抑制曲線Fig.1Inhibitory effect on monophenolase activity of rosinase

在一定濃度范圍（5 mg/mL～20 mg/mL）內(nèi)多酚提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率呈劑量依賴效應(yīng)關(guān)系（y= 2.357 7x+20.1，R2=0.999 4），即抑制率隨著樣品濃度的增大而增大。根據(jù)線性回歸方程獲得多酚提取物對(duì)酪氨酸酶活性的半抑制濃度IC50為12.68 mg/mL。

2.2.2多酚提取物對(duì)酪氨酸酶二酚酶抑制活性的影響

龍眼核多酚提取物對(duì)酪氨酸酶活性抑制率的量效關(guān)系見圖2。

圖2　對(duì)二酚酶抑制曲線Fig.2Inhibitory effect on diphenolase activity of ty tyrosinase

在一定濃度范圍內(nèi)（5 mg/mL～20 mg/mL）多酚提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率呈劑量依賴效應(yīng)關(guān)系（y= 3.400 1x+9.855，R2=0.999 8），即抑制率隨著樣品濃度的增大而增大。根據(jù)線性回歸方程獲得多酚提取物對(duì)酪氨酸酶活性的半抑制濃度IC50為11.81 mg/mL。

2.3多酚提取物對(duì)酪氨酸酶二酚酶活性抑制的動(dòng)力學(xué)分析

2.3.1多酚提取物對(duì)不同濃度酪氨酸酶二酚的抑制作用

多酚提取物對(duì)不同濃度酪氨酸酶二酚的抑制作用結(jié)果如圖3所示。

圖3　多酚提取物對(duì)不同濃度酪氨酸酶二酚酶活性抑制作用Fig.3Inhibitory effect of polyphenol extracts on different concentrations of diphenolase of tyrosinase

在底物濃度和龍眼核多酚提取物質(zhì)量濃度不變的條件下，隨著酪氨酸酶濃度的提高，反應(yīng)體系的吸光度值OD475呈線性增加；而在底物濃度和酪氨酸酶濃度不變的情況下，OD475隨多酚提取物質(zhì)量濃度的提高而下降。以O(shè)D475對(duì)酪氨酸酶濃度［En］作圖，直線斜率隨提取物質(zhì)量濃度增加而下降，說明龍眼核多酚提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用不是通過降低有效酶量，而是通過降低酶活性實(shí)現(xiàn)的，表現(xiàn)為可逆性抑制作用。

2.3.2多酚提取物對(duì)酪氨酸酶二酚酶的抑制動(dòng)力學(xué)

研究龍眼核多酚對(duì)酪氨酸酶二酚酶抑制作用類型，在酶活測(cè)定體系中，固定酶的濃度，改變L-DOPA濃度，測(cè)定不同濃度抑制劑對(duì)酶活力的影響，作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，判斷抑制劑的抑制類型。對(duì)二酚酶的Lineweaver-Burk圖如圖4所示，抑制劑與酶結(jié)合時(shí)的平衡常數(shù)如圖5所示。

圖4　對(duì)二酚酶的Lineweaver-Burk圖Fig.4Lineweaver-Burk plots for inhibition of poyphenol extract on diphenolase of tyrosinase

圖5　抑制劑與酶結(jié)合時(shí)的平衡常數(shù)Fig.5The inhibition constant（KI）

由Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖（圖4）得到1組縱軸截距不變的直線，說明龍眼核多酚作為酪氨酸酶抑制劑，不改變酶促反應(yīng)的最大反應(yīng)速度（Vmax），只影響米氏常數(shù)（Km），其抑制類型為競(jìng)爭(zhēng)性類型，表現(xiàn)為酶對(duì)底物的親和力下降，抑制劑的存在阻礙了底物和酶的結(jié)合。相反，底物和酶的結(jié)合也阻止抑制劑與酶分子的結(jié)合，底物與抑制劑同酶分子的結(jié)合是互相競(jìng)爭(zhēng)的，增加底物濃度可以排除抑制劑對(duì)酶的效應(yīng)，表現(xiàn)出酶反應(yīng)的Vmax不隨著抑制劑濃度增大而變化。由此說明龍眼核多酚只能與游離酶（E）結(jié)合，而不能與酶-底物絡(luò)合物（ES）結(jié)合。

以圖5中各濃度抑制劑對(duì)應(yīng)的直線結(jié)合米氏方程計(jì)算出米氏常數(shù)（Km），以Km對(duì)抑制劑濃度作圖（圖5），獲得一條斜率為0.538的直線，進(jìn)而可知該抑制劑與酶結(jié)合時(shí)的平衡常數(shù)，即抑制常數(shù)（KI）為0.538 mg/mL。

3　討論

酪氨酸酶由兩個(gè)含銅離子位點(diǎn)構(gòu)成其活性中心［1］，同時(shí)具有單酚酶和二酚酶活性［2］。酪氨酸酶首先將L-酪氨酸羥基化生成L-多巴，然后將L-多巴氧化成多巴醌，最后多巴醌在酶促和非酶促反應(yīng)下生成色素物［19］。通過對(duì)該關(guān)鍵酶的調(diào)控，抑制其活性，可以減少黑色素的形成。

本文選用采用超聲提取龍眼核多酚，并測(cè)定其對(duì)酪氨酸酶活性的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明：在一定濃度范圍內(nèi)（5 mg/mL～20 mg/mL），龍眼核多酚提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率呈劑量依賴效應(yīng)關(guān)系，即抑制率隨著樣品濃度的增大而增大，對(duì)酪氨酸的單酚酶、二酚酶活力均有抑制作用，這與市面常用酪氨酸抑制劑曲酸［20］、熊果甙［21］的研究吻合，這可能是由于龍眼核多酚提取物中含有鞣花酸、沒食子酸、柯里拉京、沒食子酸乙酯等［22-23］，有大量酚羥基存在，其與底物結(jié)構(gòu)相似可以結(jié)合酪氨酸酶的銅離子活性中心，并可清除活性氧而拮抗酪氨酸酶的激活。龍眼核多酚提取物對(duì)酪氨酸的單酚酶、二酚酶活力半抑制濃度IC50分別為12.68、11.81 mg/mL，這低于文獻(xiàn)報(bào)道的一些植物多酚提取物的IC50，如白芨水提取物［24］（二酚酶IC5028 mg/mL）、低榆多酚70%丙酮提取物［25］（二酚酶IC5014.5 mg/mL），提示了龍眼核多酚提取物具有良好的酪氨酸酶抑制作用，且效果優(yōu)于部分植物多酚提取物。

根據(jù)抑制劑與酶作用的特點(diǎn)，酶抑制類型可分為可逆抑制和不可逆抑制，前者又分為競(jìng)爭(zhēng)性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制、混合型抑制及緩慢結(jié)合型抑制。其中，競(jìng)爭(zhēng)性抑制的主要機(jī)理為底物類似物結(jié)合酶的銅離子活性中心抑制酶活性；混合型的主要機(jī)理為抑制劑對(duì)酶活性中心的內(nèi)源橋基的影響；非競(jìng)爭(zhēng)性的主要機(jī)理為抑制劑對(duì)氧自由基的清除作用以及抑制劑與酶活性中心以外的氨基酸殘基結(jié)合。

經(jīng)抑制動(dòng)力學(xué)研究，證實(shí)龍眼核多酚對(duì)酪氨酸二酚酶為可逆競(jìng)爭(zhēng)性抑制。即龍眼核多酚與底物同酶的結(jié)合是相互競(jìng)爭(zhēng)的，酶分子的空間結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生不可逆性的變化。這與大多數(shù)酪氨酸酶抑制劑的抑制類型吻合［26］，如槐花提取物［27］、川穹提取物［28］、熊果甙［21］等對(duì)酪氨酸二酚酶均為競(jìng)爭(zhēng)性抑制。這提示龍眼核多酚雖然具有良好體外清除自由基的活性，但發(fā)揮對(duì)酪氨酸酶二酚酶的抑制作用時(shí)，主要依賴提取物中的多酚與底物左旋多巴有相似的結(jié)構(gòu)。龍眼核多酚競(jìng)爭(zhēng)性與酪氨酸酶銅離子活性中心結(jié)合，將黑色素合成的反應(yīng)鏈中部分酪氨酸酶帶走，降低酪氨酸酶在該反應(yīng)體系的濃度，從而抑制色素物質(zhì)的合成。這與國(guó)外部分文獻(xiàn)報(bào)道一致，Kubo［29］等對(duì)旋復(fù)花異囊菊黃酮醇提取物的研究表明，其中一種黃酮醇物質(zhì)——槲皮素通過與酪氨酸酶活性中心結(jié)合而降低酪氨酸酶活性，No J K［30］等也發(fā)現(xiàn)綠茶提取物競(jìng)爭(zhēng)性抑制酪氨酸酶。

結(jié)合本課題組前期試驗(yàn)，龍眼核多酚不僅可作為抗氧化物質(zhì)潛在資源，也是天然的酪氨酸酶可逆競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，具有較高的應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。然而龍眼核多酚提取物為混合物，其成分較復(fù)雜，本研究結(jié)果為多種物質(zhì)對(duì)酪氨酸酶的綜合抑制作用。下一步可分離龍眼核多酚提取物活性單體化合物并研究其對(duì)酪氨酸酶的抑制功效，從中尋找到高活性的天然酪氨酸酶抑制劑。

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Inhibitory Effect of Polyphenol Extracted from Longan Seed on Tyrosinase

GUAN Tian-wang1，YANG Hang1，LIU Jia-yu1，TANG Fu-cai2，WANG Man-ni3，LI Xun4，LIN Jin-yu4，QIN Ling-ling5，WU Wen-hao6，*
（1.The Second Clinical College，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510000，Guangdong，China；2.The First Clinical College，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510000，Guangdong，China；3.KingMed School of Laboratory Medicine，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510000，Guangdong，China；4.The Third Clinical College，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510000，Guangdong，China；5.Nursing College，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510000，Guangdong，China 6.The Medicine College，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510000，Guangdong，China）

This study evaluated the tyrosinase inhibitory activity of polyphenol extracted from longan seed.The inhibitory kinetics of tyrosinase including monophenolase and diphenolase were studied via enzymological kinetic method using L-Tyrosine and L-Dopa as substrates.It was found that polyphenol extracted from longan seed showed significant inhibitory activities against monophenolase and diphenolase in tyrosinase，and the IC50values were 12.68mg/mL and 11.81mg/mL，respectively.Utilizing kinetic analysis，the inhibition effect was conformed to be a reversible competitive inhibition，and the inhibition constant（KI）was determined to be 0.538mg/mL.

tyrosinase；longanseed；polyphenol；inhibitoryeffect；enzymekinetics

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.17.004

2016-05-31

2015年廣東省大學(xué)生科技創(chuàng)新培育專項(xiàng)資金項(xiàng)目（pdjh20150439）；2015-2016年度廣州醫(yī)科大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（2015B002）；2016年廣東省大學(xué)生科技創(chuàng)新培育專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（pdjh2016a0406）；廣州醫(yī)科大學(xué)博士科研啟動(dòng)項(xiàng)目（20121C23）；廣東省中醫(yī)藥局建設(shè)中醫(yī)藥強(qiáng)省科研項(xiàng)目（20132208）；廣東高校優(yōu)秀青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（2013LYM_007）

關(guān)天旺（1992—），男（漢），本科在讀，主要從事天然藥物研究。

吳文浩（1983—），男，講師，博士，主要從事藥物化學(xué)研究。