桑鵬，高春燕

（大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理671000）

不同極性地參多酚抗氧化活性的比較

桑鵬，高春燕*

（大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理671000）

采用分級(jí)萃取的方法提取了地參多酚粗提液中的不同極性多酚，同時(shí)采用DPPH自由基清除活性、FRAP和TEAC評(píng)價(jià)了不同極性地參多酚的抗氧化活性。結(jié)果表明，液-液萃取的方法可以實(shí)現(xiàn)不同極性地參多酚的有效分離，且隨著萃取溶劑極性的增加，其酚含量逐漸升高；酚含量與FRAP具有顯著的相關(guān)性，DPPH自由基清除活性與TEAC間具有顯著的相關(guān)性。

地參；液-液萃?。环宇惢衔?；抗氧化活性

由于人工合成抗氧化劑的安全性問題，研究與開發(fā)廣譜、安全、天然的抗氧化劑成為當(dāng)今食品添加劑研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)之一［1］，已有研究表明［2］，攝入抗氧化物質(zhì)可以有效抵消自由基氧化對心腦血管疾病、癌癥、衰老等造成的損傷。酚類化合物不僅有抗炎癥、抗氧化、抗腫瘤活性和抗心血管疾病的作用［3］，還有清除自由基和羥基取代的高反應(yīng)性作用，使其有很好的抗氧化活性［4］，而天然酚類化合物是植物體內(nèi)最豐富的次生代謝產(chǎn)物［5］。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)類黃酮的攝入量與心臟病、中風(fēng)等心血管疾病及肺癌、胃癌的發(fā)生率成反比［4］，而酚類化合物含有大量的類黃酮。

地參（L.lucidus Turcz.），又名蟲草參、地藕、甘露子等，唇形科地筍屬多年生草本植物，主要分布在我國云南，其地下根莖為藥用及食用部分［6-7］。野生地參古有“蔬菜珍品”的美譽(yù)，是藥食兼用的佳品［7］?！吨腥A本草》中記載，其功能可與冬蟲夏草相媲美，曬干后可入藥［8］，具有活血、利尿、通經(jīng)、滋陽、潤燥、調(diào)血脂、通九竅、利關(guān)節(jié)、養(yǎng)氣血等功能，主治腹痛、水腫、產(chǎn)后瘀血、跌打損傷等癥［9］；食用后具有提神醒腦、開胃化食、補(bǔ)肝腎兩虛、強(qiáng)腰膝筋骨之功效。臨床常用其治療患有絨毛膜癌、葡萄胎、肺癌、肝癌等癌瘤的中屬淤血阻滯者［10］。但是，翻閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，關(guān)于地參中酚類化合物的分離及抗氧化性研究較少，本研究采用液-液萃取法對地參多酚粗提液中不同極性多酚進(jìn)行分離，并比較不同極性地參多酚的酚含量和抗氧化活性，以期為地參的開發(fā)和利用提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

地參：分別于2013年11月19日（T1），2013年12月22日（T2）和2014年1月25日（T3）采自云南省劍川縣沙溪鎮(zhèn)四聯(lián)村（S1）和鰲鳳村（S2）。

DPPH（1，1苯基-2-苦肼基自由基）、沒食子酸、Trolox（水溶性維生素E）、TPTZ（三吡啶三吖嗪）：購自Sigma公司（Sigma-Aldrich，Steinheim，Germany）；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

SHZ-DⅢ予華牌循環(huán)水真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；WFJ2000型可見分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1不同極性地參多酚的提取分離

取地參樣品各5 g，加入10倍體積的80%甲醇，于室溫下超聲波輔助提取10 min，真空抽濾，殘?jiān)酝瑯臃椒ㄖ貜?fù)提取2次，合并提取液，于35℃下真空濃縮，得地參多酚粗提液。分別向地參多酚粗提液中加入等體積的石油醚，充分振蕩后分層，得到石油醚層和水層；在水層中再加入等體積的氯仿，振蕩后分層，得到氯仿層和水層；同理，再在水層中依次加入乙酸乙酯和正丁醇，分別得到乙酸乙酯層、正丁醇層和水層，每種溶劑萃取各重復(fù)5次。將各極性部位萃取液合并，并定容至50 mL，即得到不同極性的地參多酚提取液。1.3.2不同極性地參多酚的總酚含量的測定

參照Meda等［11］的方法，并稍作修改。準(zhǔn)確吸取適量待測液，加入100 μL 1.0 mol/L的福林酚試劑，3 min后加入2 mL7.5%的碳酸鈉溶液，搖勻，用蒸餾水定容至5 mL刻度處，暗室反應(yīng)40 min，于760 nm波長處測定吸光度值。以沒食子酸做標(biāo)準(zhǔn)曲線（0～5.8 μg/mL），得回歸方程：y=0.101 1x+0.046 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 8。樣品中地參多酚含量測定結(jié)果以沒食子酸等量每克地參干重表示（mg GAE/g DW）。

1.3.3不同極性地參多酚的鐵還原抗氧化能力（FRAP）的測定

參照Netzel等［12］的方法，并稍作修改。用40 mmol/L的HCl配制成10 mmol/L TPTZ溶液，然后與新鮮配制的0.3 mol/L的乙酸鈉緩沖液，20 mmol/L的FeCl3· 6H2O溶液以1：10：1（體積比）的比例混合成FRAP工作液，使用前于37℃水浴中保溫30 min。分別將0.1 mL的試樣，1.4 mL FRAP工作液與2 mL蒸餾水混合，于37℃水浴中保溫30 min，593 nm處測吸光度值。以FeSO4·7H2O做標(biāo)準(zhǔn)曲線（100 μmol/L～1 000 μmol/L），得回歸方程y=0.0006x-0.0118，相關(guān)系數(shù)R2=0.9961。地參多酚各提取液中鐵還原抗氧化能力結(jié)果以μmol Fe（Ⅱ）每克地參干重表示（μmol Fe（Ⅱ）/g DW）。

1.3.4不同極性地參多酚的DPPH自由基清除能力的測定

參照Atoui等［13］的方法，并稍作修改。準(zhǔn)確移取各樣品液0.5 mL，加入60 μmol/L 3.5 mL DPPH甲醇溶液，常溫下避光反應(yīng)30 min于517 nm波長處測定吸光度值。以0.5 mL甲醇+3.5 mLDPPH溶液的吸光度值作對照，DPPH自由基清除能力以其清除率表示。各部分提取液的DPPH自由基清除率通過以下公式計(jì)算：

式中：A1為0.5 mL樣品溶液+3.5 mL DPPH溶液的吸光度值；A0為0.5 mL甲醇溶液+3.5 mL DPPH溶液的吸光度值。

1.3.5不同極性地參多酚的ABTS陽離子自由基清除活性的測定

參考Re等［14］的方法，并稍作修改。將樣品液25 μL與ABTS+工作液2.5 mL混合，6 min后在734 nm處測量吸光度值。以Trolox做標(biāo)準(zhǔn)曲線（100 μmol/L～1 000 μmol/L），得回歸方程為y=-0.000 4x+0.552 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3，地參多酚各提取液中Trolox等量抗氧化活性結(jié)果以μmol/L Trolox等量每克地參干重表示（μmol TE/g DW）。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

2　結(jié)果與分析

2.1不同極性地參多酚提取液酚含量

不同極性地參多酚提取液酚含量見表1。由表1可以看出，水提多酚的酚含量最高，石油醚提多酚的最低，大體上講，隨著萃取溶劑極性的增加，地參酚含量逐漸升高，說明地參多酚主要以極性酚為主。王畢妮［15］等人的研究結(jié)果表明，紅棗多酚以極性多酚為主，這與本研究的結(jié)果一致。因此，為了獲得高抗氧化活性的地參多酚，可以采用不同極性有機(jī)溶劑分級(jí)萃取的方法。結(jié)果表明，采收期和采收地點(diǎn)對不同極性地參多酚含量的影響是有差異的，如水提和乙酸乙酯提多酚，S1采收的酚含量隨著采收期的延后而升高，S2采收的先降低后升高，而正丁醇提多酚，S1和S2采收的酚含量都呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。說明在地參的生長發(fā)育過程中，由于不同采收地土壤、灌溉、田間管理的差異，不同極性的多酚其合成和代謝存在差異。

表1　不同極性地參多酚提取液酚含量Table 1Total phenolic extracts of L.lucidus Turcz.poenolic compounds with different polarities mg GAE/g DW

2.2不同極性地參多酚提取液抗氧化活性

不同極性地參多酚提取液抗氧化活性的測定結(jié)果見表2。就鐵還原抗氧化能力而言，地參水提多酚鐵還原抗氧化能力最強(qiáng)，其次是正丁醇和乙酸乙酯提多酚，石油醚及氯仿提多酚鐵還原抗氧化能力較弱；就DPPH自由基清除活性而言，地參正丁醇和乙酸乙酯提多酚的DPPH自由基清除率較高，其次是水提多酚，接下來是石油醚提多酚，氯仿提多酚清除率最低，說明地參正丁醇和乙酸乙酯提多酚對DPPH自由基具有很強(qiáng)的清除能力；就Trolox等量抗氧化活性而言，正丁醇、乙酸乙酯和水提多酚的Trolox等量抗氧化活性較強(qiáng)，石油醚及氯仿提多酚的Trolox抗氧化活性較弱。

表2　不同極性地參多酚提取液抗氧化活性Table 2Antioxidant activity of L.lucidus Turcz.poenolic compounds with different polarities

2.3相關(guān)性分析

對地參不同極性多酚的酚含量與抗氧化活性進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果見表3。

表3　不同極性地參多酚抗氧化能力的相關(guān)性分析Table 3Correlation analysis of L.lucidus Turcz.poenolic compounds and antioxidant activity

酚含量與FRAP具有顯著的相關(guān)性，但與DPPH自由基清除活性和TEAC無顯著的相關(guān)性，表明在這兩種體系中，不僅酚類化合物，而且存在于提取物中的非酚類成分對DPPH自由基和ABTS+·也具有一定的清除作用。不同的抗氧化體系之間，DPPH自由基清除活性與TEAC間具有顯著的相關(guān)性，F(xiàn)RAP與DPPH自由基清除活性和TEAC間無顯著相關(guān)性。由于抗氧化體系反應(yīng)機(jī)理的差異，不同的抗氧化體系試驗(yàn)結(jié)果并不都呈顯著正相關(guān)。

3　結(jié)論

大體上講，隨著萃取溶劑極性的增加，地參酚含量逐漸升高，即水層＞正丁醇層＞乙酸乙酯層＞氯仿層＞石油醚層，且S1采收的地參酚含量高于S2；不同極性地參多酚提取液抗氧化活性顯示出多樣性，乙酸乙酯、正丁醇和水提多酚具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力、鐵還原抗氧化能力和Trolox等量抗氧化活性；酚含量與FRAP具有顯著的相關(guān)性，DPPH自由基清除活性與TEAC間具有顯著的相關(guān)性，F(xiàn)RAP與DPPH自由基和TEAC間無顯著相關(guān)性。

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［15］王畢妮，黃慶瑗，高慧，等.不同極性紅棗多酚的抗氧化活性比較［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2014，40（10）：142-145收稿日期：2015-10-18

Comparison of Antioxidant Activity of Lycopus lucidus Turcz.Polyhenols with Different Polarities

SANG Peng，GAO Chun-yan*
（Public Health School of Dali University，Dali 671000，Yunnan，China）

Organic solvents with different polarities were used to extract L.lucidus Turcz.polyphenols.DPPH radical scavenging capacity，F(xiàn)RAP and TEAC were used to evaluate the antioxidant activities of L.lucidus Turcz.polyphenols with different polarities.The results showed that liquid-liquid extraction was a successful method for separating L.lucidus Turcz.polyphenols with different polarities.As the polarity of extract solvents was increased，the phenolic content increased gradually.Significant correlation was found between phenolic content and FRAP，and DPPH radical scavenging capacity and TEAC.

LycopuslucidusTurcz.；liquid-liquidextraction；phenoliccompounds；antioxidantactivity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.17.002

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31301455）

桑鵬（1987—），男（漢），在讀碩士研究生，研究方向：營養(yǎng)與慢性病。

高春燕（1981—），女，副教授，碩士生導(dǎo)師，博士，從事植源性食品資源開發(fā)與利用。