沈 瑾

(山東省新泰市農(nóng)業(yè)局，山東新泰 271200)

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電刺激改善牛肉嫩度的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

沈 瑾

(山東省新泰市農(nóng)業(yè)局，山東新泰 271200)

[目的]研究電刺激處理對宰后成熟過程中牛肉蛋白質(zhì)的影響。[方法]利用牛背最長肌雙向電泳凝膠體系研究電刺激后牛背最長肌中的差異蛋白質(zhì)，分析宰后1和3 d時電刺激處理牛背最長肌中有顯著降解的差異蛋白點。[結(jié)果]與未電刺激樣品相比，在宰后1和3 d電刺激處理牛背最長肌中有12個蛋白點表達明顯下調(diào)，分為9種蛋白質(zhì)：肌間線蛋白、肌鈣蛋白-T、肌球蛋白結(jié)合蛋白H；肌酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶；過氧化物氧化還原酶、磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白；組蛋白、甲基轉(zhuǎn)移酶。[結(jié)論]電刺激后9種蛋白質(zhì)通過4條途徑影響電刺激后嫩度變化，包括糖酵解代謝途徑、鈣激活中性蛋白酶途徑、溶酶體途徑和氧化應(yīng)激途徑。電刺激通過通過4條途徑影響嫩度的信號通路表明，牛肉嫩化與氧化、凋亡有密切聯(lián)系；電刺激在一定程度上抑制增殖，加速氧化和凋亡，加快嫩化。

牛背最長??；電刺激；嫩度；蛋白質(zhì)降解；差異蛋白質(zhì)組

嫩度是決定牛肉食用品質(zhì)的最重要指標(biāo)[1]。大量調(diào)查表明，消費者可以將不同嫩度的肉區(qū)分出來，并愿意以高價購買嫩度較好的牛肉。嫩度的高低在一定程度上決定牛肉食用品質(zhì)的優(yōu)劣[2]。牛肉的嫩度除受肉牛年齡和品種等生理方面的影響外，還包括牛屠宰后所采取的處理方式，如冷卻處理、電刺激處理等。電刺激處理對宰后成熟過程中牛肉蛋白質(zhì)降解的影響仍是肉品界的研究熱點。研究表明，電刺激確實提高了宰后肌肉蛋白質(zhì)的降解速度，其原因可能是電刺激導(dǎo)致蛋白質(zhì)的降解。蛋白質(zhì)組學(xué)的核心為雙向凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)，筆者研究電刺激處理對宰后成熟過程中牛肉蛋白質(zhì)的影響，以期為研究牛肉嫩度的改善提供新的思路。

1　材料與方法

1.1材料選擇體重(629.0±50.3)kg、18月齡的雜交黃牛(延邊?！廖鏖T塔爾牛)20頭，并隨機分成2組。肉牛按伊斯蘭屠宰流程屠宰。宰后5 min內(nèi)，對其中一組進行電刺激(EST-601型電刺激儀，電壓為42 V，電流為0.7 A，頻率為50 Hz，時間為40 s；Electrical stimulation-ES)，另一組未電刺激為對照組(No electrical stimulation-NS)。胴體剝皮、劈半后進入成熟車間(0～4 ℃，濕度90%，風(fēng)速0.5 m/s)冷卻、成熟，宰后1、3 d時在胴體12～13肋骨間取50 g肉塊放入液氮內(nèi)速凍后保存在-80 ℃，備用。

1.2樣品處理取冷凍肌肉組織100 mg，加入1 mL裂解液孵化40 min，裂解液含8 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、2% CHAPS、65 mmol/L DTT、1%兩性電解質(zhì)(pH 3～10)。12 000 r/min離心60 min，取上清，使用2D quant kit 定量試劑盒進行蛋白濃度定量，分裝到離心管，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3雙向電泳將含有400 μg樣品的再水化液加到24 cm IPG膠條中，過夜使膠條再水化。再水化液包括8 mol/L尿素、0.5% CHAPS、0.28% DTT、1%IPG buffer(pH 3～10)、10%甘油、溴酚藍，等電聚焦條件為50 V水化12 h，100 V 2 h，200 V 1 h，500 V 30 min，1 000 V 20 min，3 000 V 20 min。等電聚焦后，在10 mL含50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)、6 mol/L 尿素、2% SDS、20%甘油、溴酚藍、5 mmol/L TBP的平衡液中平衡IPG膠條，然后將平衡后的IPG膠條轉(zhuǎn)移到12.5% SDS凝膠上，進行第二向十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，最初使用每塊膠10 mA 1 h，待蛋白質(zhì)樣品在SDS-PAGE凝膠的濃縮膠上濃縮成一條線后，開始使用每塊膠20 mA，直至溴酚藍到達底部邊緣時停止電泳。凝膠在含考馬斯亮藍G-250、95%乙醇、85%磷酸的染色液中染色，搖床振蕩30 min，使用超純水脫色2 h。電泳圖譜染色完畢后，采用掃描儀對雙向電泳凝膠圖進行掃描分析，分辨率為300 dpi。采用凝膠圖像分析軟件PDQuest7.0分析圖像，對雙向電泳凝膠上的差異蛋白點進行檢測分析，考染后有2倍以上差異的蛋白點被鑒定出來，最后對差異蛋白點進行質(zhì)譜分析。

2　結(jié)果與分析

經(jīng)考馬斯亮藍染色的雙向電泳凝膠通過計算機輔助圖像軟件的分析，檢測到650～669個點。宰后1和3 d時電刺激處理樣品的雙向電泳凝膠圖譜見圖1、2。

注：蛋白質(zhì)上樣量為400 μg，膠條pH 3～10，膠條長度24 cm，SDS凝膠為12.5%。Note：Protein(400 μg)was loaded and separated in the IPG 3-10 strip(24 cm)and an SDS gel(12.5% T).圖1　宰后1 d時電刺激與未電刺激處理牛背最長肌蛋白質(zhì)表達的比較Fig.1　Comparative analysis of the expressed protein patterns between no simulated group and 1 d post-ES group

對宰后1和3 d時ES和NS處理樣品經(jīng)雙向電泳并對凝膠染色后，使用PDQuest2D軟件對不同凝膠重復(fù)性進行分析，發(fā)現(xiàn)有6個蛋白質(zhì)點的蛋白豐度差異達2倍以上。對雙向電泳后得到的顯著差異蛋白質(zhì)點進行質(zhì)譜分析，得到肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)。以MASCOT離子搜索模式，檢索NCBI真核生物的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，共成功鑒定出12個蛋白點。其中，細胞骨架蛋白4個，激酶抑制蛋白1個，代謝酶4個，過氧化物氧化還原酶2個，甲基轉(zhuǎn)移酶1個(表1、2)。

注：蛋白質(zhì)上樣量為400 μg，膠條pH 3～10，膠條長度24 cm，SDS凝膠為12.5%。Note：Protein(400 μg)was loaded and separated in the IPG 3-10 strip(24 cm)and an SDS gel(12.5% T).圖2　宰后3 d時電刺激與未電刺激處理牛背最長肌蛋白質(zhì)表達的比較分析Fig.2　Comparative analysis of the expressed protein patterns in between no simulated group and 3 d post-ES group

表1　宰后1 d時電刺激處理牛背最長肌樣品中鑒定的差異蛋白點

表2　宰后3 d時電刺激處理牛背最長肌樣品中鑒定的差異蛋白點

由表1、2可知，與未電刺激樣品相比，在宰后1和3 d電刺激處理牛背最長肌中有12個蛋白點表達明顯下調(diào)，分為9種蛋白質(zhì)：肌間線蛋白(Desmin)、肌鈣蛋白-T(Troponin T alpha isoform)、肌球蛋白結(jié)合蛋白H(Myosin binding protein H)；肌酸激酶(Creatine kinase，2個)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(Triosephosphate isomerase，2個)；過氧化物氧化還原酶(Peroxiredoxin-6，2個)、磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(Phosphatidylethanolamine-binding protein)；組蛋白(Histone H3.3-like isoform 2)、甲基轉(zhuǎn)移酶(Methyltransferase)。

3　討論

3.1電刺激通過糖酵解代謝途徑影響嫩度動物屠宰后，肌肉中的能量代謝系統(tǒng)從有氧代謝轉(zhuǎn)為無氧代謝，ATP主要來源于糖原降解為乳酸及磷酸肌酸中磷酸轉(zhuǎn)移給ADP[3]。肌酸激酶能夠催化ATP與ADP間磷酸基團的可逆轉(zhuǎn)移。研究表明，電刺激能夠加速宰后的糖酵解[4-6]，且發(fā)現(xiàn)有些代謝酶因為電刺激而導(dǎo)致表達改變[7]。另外，在糖酵解及糖異生過程中，磷酸丙糖異構(gòu)酶(TIM)發(fā)揮了作用，催化3-磷酸甘油醛與磷酸二羥丙酮[8]間的轉(zhuǎn)換。磷酸丙糖異構(gòu)酶已被用作藥物設(shè)計的一個靶目標(biāo)[9]。屠宰后糖酵解酶的增加有可能是為了增加糖酵解速率，以維持ATP的生成。因此，電刺激后代謝酶Creatine kinase和Triosephosphate isomerase表達下調(diào)，表明電刺激加快糖酵解途徑，Creatine kinase和Triosephosphate isomerase快速消耗，防止肌肉快速冷卻時的冷收縮，使胴體內(nèi)能量大量消耗，ATP轉(zhuǎn)化ADP為磷酸鹽，釋放出鈣離子，乳酸積累，形成高溫低pH環(huán)境，嫩度提高。

3.2電刺激通過鈣激活中性蛋白酶途徑影響嫩度研究表明，細胞骨架蛋白Titin、Nebulin、Desmin和Troponin-T的降解使肌原纖維發(fā)生一系列的物理、化學(xué)和結(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致肌纖維小片化，破壞了肌纖維結(jié)構(gòu)的完整性，并最終改善了肉嫩度[10-11]。電刺激電流通過神經(jīng)系統(tǒng)或直接使肌膜去極化引起肌肉收縮，使肉的糖酵解速率提高，肉胴體溫度升高，pH迅速降低，進而影響Calpain/Calpastatin的比例[12]，也可能是肌漿鈣離子濃度較高激活Ca1pains蛋白酶體系，蛋白質(zhì)降解加速，并最終導(dǎo)致肉的快速嫩化。電刺激后骨架蛋白Desmin、Troponin T alpha isoform、Myosin binding protein H表達下調(diào)，表明電刺激激活Calpains蛋白酶體系，加速降解骨架蛋白Desmin、Troponin T alpha isoform、Myosin binding protein H，剪切力降低，嫩度提高。

3.3電刺激通過溶酶體途徑影響嫩度溶酶體內(nèi)的酶均屬于酸性水解酶，反應(yīng)的最適pH為5.0左右，溶酶體膜有質(zhì)子泵，將H+泵入溶酶體，使其pH降低。如果細胞pH下降至5.0左右，會導(dǎo)致酸性水解酶活化，水解溶酶體膜，最終導(dǎo)致溶酶體膜裂解，溶酶體酶釋放，使細胞、組織自溶。當(dāng)細胞中pH接近中性時，Peroxiredoxin-6在肌漿中發(fā)揮過氧化物氧化還原酶活性，當(dāng)細胞中pH為5.0左右時，Peroxiredoxin-6在溶酶體發(fā)揮Ca2+依賴的磷脂酶 A2活性，利用溶酶體途徑來調(diào)控肉類中骨架蛋白的降解[13-14]。電刺激后Peroxiredoxin-6表達下調(diào)，表明電刺激后pH不斷下降，直到pH為5.4左右，肌漿中Ca2+濃度升高，Peroxiredoxin-6主要發(fā)揮Ca2+依賴的磷脂酶 A2活性，導(dǎo)致溶酶體膜破裂，溶酶體內(nèi)的水解酶釋放，使肌肉蛋白水解，嫩度提高。

3.4電刺激通過氧化應(yīng)激途徑影響嫩度Peroxiredoxin是近年來發(fā)現(xiàn)的可以保護機體細胞免受氧化劑損傷的蛋白質(zhì)家族，可以清除機體內(nèi)的H2O2和烷基過氧化物，通過其過氧化物酶活性，保護細胞免受氧化損傷。Peroxiredoxin-6是一個雙功能蛋白，具有過氧化物酶和磷脂酶A2雙重活性。Peroxiredoxin-6在pH接近中性時，發(fā)揮過氧化物氧化還原酶活性，通過p38 MAPK級聯(lián)途徑刺激增殖和抑制細胞凋亡[15-17]。電刺激后Peroxiredoxin-6表達下調(diào)，表明電刺激后pH不斷下降，直至pH為5.4左右，肌漿中Ca2+濃度升高，Peroxiredoxin-6主要發(fā)揮Ca2+依賴的磷脂酶 A2活性，通過溶酶體途徑使肌肉蛋白水解，在一定程度上抑制了p38 MAPK級聯(lián)途徑，抑制增殖，加速氧化凋亡，嫩度提高。

哺乳動物中的PEBP具有雙重作用，包括脂質(zhì)結(jié)合及使絲氨酸蛋白酶受到抑制[18]。牛屠宰后胴體內(nèi)產(chǎn)生活性氧，激活Ras-MAPK級聯(lián)途徑，PEBP與Raf-1相互起作用，抑制Ras-MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。電刺激后PEBP表達下調(diào)，表明電刺激加速PEBP抑制Ras-MAPK級聯(lián)途徑，抑制增殖，加速氧化凋亡，嫩度提高。PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)細胞的增殖，避免細胞發(fā)生凋亡，且能夠激活甲基轉(zhuǎn)移酶MT[19-20]。而MT表達越低，甲基化水平越低，凋亡越快。電刺激后組蛋白和甲基轉(zhuǎn)移酶下調(diào)，表明甲基轉(zhuǎn)移酶表達降低，組蛋白甲基化水平降低，加速凋亡，在一定程度上抑制PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制增殖，加速氧化凋亡，嫩度提高。

電刺激后Peroxiredoxin-6、PEBP、Histone、MT表達下調(diào)，表明電刺激通過抑制p38 MAPK級聯(lián)途徑、Ras-MAPK級聯(lián)途徑和PI3K/Akt信號通路，抑制增殖，加速氧化凋亡，嫩度提高。

4　結(jié)論

該研究運用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究了電刺激宰后1和3 d牛背最長肌中降解的蛋白質(zhì)。利用雙向電泳技術(shù)和軟件分析鑒定，確定在電刺激宰后1和3 d牛背最長肌中有12個蛋白點表達明顯下調(diào)，分為9種蛋白質(zhì)：肌間線蛋白(Desmin)、肌鈣蛋白-T(Troponin T alpha isoform)、肌球蛋白結(jié)合蛋白H(Myosin binding protein H)；肌酸激酶(Creatine kinase，2個)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(Triosephosphate isomerase，2個)；過氧化物氧化還原酶(Peroxiredoxin-6，2個)、磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(Phosphatidylethanolamine-binding protein，PEBP)；組蛋白(Histone H3.3-like isoform 2)、甲基轉(zhuǎn)移酶(Methyltransferase)。分析電刺激處理后的差異蛋白質(zhì)影響嫩度的作用機制表明，電刺激處理后鑒定的9種差異蛋白質(zhì)主要通過4條途徑影響嫩度變化，分別為糖酵解代謝途徑、鈣蛋白酶途徑、溶酶體途徑、氧化應(yīng)激途徑。電刺激通過氧化應(yīng)激途徑影響嫩度的信號通路表明，牛肉嫩化與氧化、凋亡有密切聯(lián)系；電刺激在一定程度上抑制增殖，加速氧化和凋亡，加快嫩化。具體機制還需要進一步試驗驗證。

該研究鑒定出的代謝酶為進一步研究成熟嫩化、氧化和凋亡提供了新思路，如對牛肉中基因進行分離及遺傳效應(yīng)分析，基因的敲除或者過表達，啟動子克隆和轉(zhuǎn)錄因子的研究，可以進行基因結(jié)構(gòu)、時空表達譜、多態(tài)性及性狀關(guān)聯(lián)分析等方面的研究，建立與嫩度的關(guān)系，從而指導(dǎo)生產(chǎn)。從基因水平上，進一步研究代謝通路及基因網(wǎng)絡(luò)具有重要的理論意義。

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The Proteomic Analysis of Beef Tenderness after Electrical Stimulation

SHEN Jin

( Xintai Agricultural Bureau,Xintai,Shandong 271200)

[Objective]To research the effects of electrical stimulation (ES) on beef protein in the mature process after slaughter.[Method]The differential proteins were identified using the system of two-dimensional electrophoresis gels on muscle longissimus to analysis the relations to tenderness in this system.Differential protein spots with significant degradation during muscle longissimus ES were analyzed after 1 and 3 d of slaughtering.[Result]Compared with no ES samples,twelve protein spots were down-regulated significantly at 1 and 3 d postmortem as a result of electrical stimulation.These proteins were identified as nine types: desmin,troponin T alpha isoform,myosin binding protein H,creatine kinase,triosephosphate isomerase,peroxiredoxin-6,phosphatidylethanolamine-binding protein,histone H3.3-like isoform 2,methyltransferase.[Conclusion]Proteins of nine types affects tenderness as a result of electrical stimulation through four pathways including glycolytic metabolic pathway,calpains pathway,lysosomal pathway,and oxidative stress pathway.These pathways indicate that meat tenderness is closely related to oxidation and apoptosis,electrical stimulation inhibites proliferation,accelerates oxidation and apoptosis and finally accelerates meat tenderization.

Muscle longissimus;Electrical stimulation;Tenderness;Protein degradation;Differential proteomics

沈瑾(1983- )，女，山東新泰人，農(nóng)藝師，博士，從事食品科學(xué)研究。

2016-07-20

TS 201.2+1

A

0517-6611(2016)25-112-04