蘭　鈞　阿　萍

西藏自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，西藏　拉薩　850000

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藥物研究

HPLC法測(cè)定藏藥二十五味珊瑚丸中β-細(xì)辛醚的含量

蘭鈞阿萍

西藏自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，西藏拉薩850000

目的：建立藏藥二十五味珊瑚丸中β-細(xì)辛醚的HPLC含量測(cè)定方法。方法：采用Waters XSELECT CSH C18色譜柱，以甲醇-水(56∶44)為流動(dòng)相，流速為1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，柱溫為35℃。結(jié)果：β-細(xì)辛醚在0.9926～2.9778μg范圍內(nèi)線性良好(r=0.9999)，平均回收率為99.27%，RSD為1.1%。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、可靠、快速、靈敏，可用于藏藥二十五味珊瑚丸的質(zhì)量控制。

二十五味珊瑚丸；β-細(xì)辛醚；高效液相色譜法；含量測(cè)定

二十五味珊瑚丸是傳統(tǒng)藏藥，由珊瑚、珍珠、青金石、珍珠母、訶子、木香、紅花、丁香、沉香、朱砂、龍骨等二十五味藥材制成，具有清熱定驚、開竅通絡(luò)、止痛的功效，用于治療“白脈病”，即中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如神志不清，身體麻木，頭昏目眩，腦部疼痛，血壓不調(diào)，頭痛，癲癇及各種神經(jīng)性疼痛[1-2]。首次收載于1995《中國(guó)藥典》標(biāo)本版，1997年被國(guó)家衛(wèi)生部批準(zhǔn)為國(guó)家中藥保護(hù)品種，目前被《中國(guó)藥典》2010年版收載?，F(xiàn)行檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)包含簡(jiǎn)單的化學(xué)反應(yīng)和西紅花、紅花主要成分的薄層色譜鑒別以及烏頭堿的限量測(cè)定。涉及的藥材少，代表性不足，缺乏組方藥材的質(zhì)控指標(biāo)及定量標(biāo)準(zhǔn)，難以保證產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定和用藥安全有效。

二十五味珊瑚丸治療癲癇等神經(jīng)性疼痛，藏菖蒲中有效成分β-細(xì)辛醚起重要作用，采用UPLC-DAD/Q-TOF-MS對(duì)二十五味珊瑚丸全方進(jìn)行了系統(tǒng)的成分分析，鑒定出6大類61個(gè)成分，其中苯丙素類β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚來(lái)自藏菖蒲，且二十五味珊瑚丸成藥中β-細(xì)辛醚含量較高[3-4]。研究表明，β-細(xì)辛醚能降低小鼠癲癇發(fā)作級(jí)別，延長(zhǎng)癲癇發(fā)作潛伏期，減少濕狗樣抖動(dòng)次數(shù)[3,5]。而β-細(xì)辛醚是主要入血入腦的成分，既是有效成分，但在高濃度下又是潛在的毒性成分，因此控制β-細(xì)辛醚的含量關(guān)系到全方的安全性和有效性[4]。本研究擬采用HPLC建立了二十五味珊瑚丸中β-細(xì)辛醚的含量測(cè)定方法，為藏藥二十五味珊瑚丸的質(zhì)量控制提供參考方法。

1　儀器與材料

1.1儀器Waters高效液相色譜儀(Waters2695泵自動(dòng)進(jìn)樣器，2998二極管陣列紫外檢測(cè)器，Waters自帶數(shù)據(jù)處理器)；超聲儀；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；十萬(wàn)分之一電子天平。

1.2材料β-細(xì)辛醚(批號(hào)：C10301000，Dr.Ehrenstorfer GmbH)；二十五味珊瑚丸(抽自青海金訶、西藏神猴、昌都光于利民、西藏甘露、西藏藏醫(yī)學(xué)院等9個(gè)生產(chǎn)企業(yè)，占全國(guó)生產(chǎn)企業(yè)的73%)。配制陰性樣品的藥材由西藏自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所標(biāo)本室提供。甲醇為色譜純(美國(guó)Fisher公司)，水為超純水。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Waters Xselect CSH C18(4.6mm×250mm，5μm)；柱溫：35℃；流動(dòng)相：甲醇-水(56∶44)；流速：1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；進(jìn)樣量：10μL。

2.2空白試驗(yàn)按處方中藥味比例，配制不含藏菖蒲的群藥，按其工藝制成陰性樣品，再按供試品溶液的制備方法制備并測(cè)定，色譜圖見圖1。表明陰性樣品溶液在與β-細(xì)辛醚對(duì)照品相同保留時(shí)間處未現(xiàn)色譜峰，故認(rèn)為無(wú)干擾。

2.3對(duì)照品溶液的制備精密稱取β-細(xì)辛醚對(duì)照品適量，加甲醇制成1mL含0.25mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.4供試品溶液的制備[4，6，7]取本品2g，研細(xì)，精密稱定，加甲醇20mL，加熱回流提取1h，過濾后，藥渣再用20mL甲醇加熱回流提取1h。合并兩次提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在30℃下減壓干燥完全，加入少量甲醇洗滌，用甲醇定容至10mL量瓶中，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得。

2.5線性關(guān)系的考察精密稱取β-細(xì)辛醚對(duì)照品適量，制得濃度溶液為0.24815mg/mL，分別進(jìn)樣2、4、6、8、10、12μl，按上述色譜條件，測(cè)定峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，回歸方程：Y=2.23e+006X-8.85e+004(r=0.9999)，結(jié)果表明，β-細(xì)辛醚在0.4963～2.9778μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6精密度試驗(yàn)取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，RSD值為 0.5%。表明儀器的精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液，按上述色譜條件，分別在室溫下放置0、2、4、8、12h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果峰面積基本不變，RSD值為0.73%，表明供試品溶液在12h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8重復(fù)性試驗(yàn)取本品1批，按照上述方法制備成6份供試品溶液，測(cè)得β-細(xì)辛醚平均含量為2.04mg/g，RSD值為1.1%。

2.9回收率試驗(yàn)精密稱取來(lái)自7個(gè)不同生產(chǎn)企業(yè)已知含量的樣品約1g，分別精密加入濃度的β-細(xì)辛醚對(duì)照品，進(jìn)樣測(cè)定，平均回收率及RSD值見表1。

表1　回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.10樣品的測(cè)定取7個(gè)生產(chǎn)企業(yè)樣品，按上述方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下，進(jìn)行含量測(cè)定。計(jì)算樣品中β-細(xì)辛醚的含量，結(jié)果見表2。

表27家生產(chǎn)企業(yè)樣品含量測(cè)定數(shù)據(jù)(n=4)

生產(chǎn)企業(yè)批號(hào)β-細(xì)辛醚(mg·g-1)RSD/%西藏神猴201503070.66060.24西藏藏諾1403040.56470.39西藏光宇利民201302041.24700.56青海金訶201504070.45050.45西藏甘露14125A1.97131.42西藏藏醫(yī)學(xué)院1407010.33431.57西藏金珠雅礱1412020.72381.32

3　討論

3.1用甲醇、水超聲提取，結(jié)果雜質(zhì)峰干擾嚴(yán)重，分離度較差。而采用甲醇加熱回流提取后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，可除去較多雜質(zhì)峰，各組分能夠良好分離。

3.2采用不同流動(dòng)相進(jìn)行考察，乙腈和0.05%磷酸溶液梯度洗脫，結(jié)果出峰時(shí)間推遲且峰拖尾，甲醇和水比例為(65∶35)，結(jié)果峰分離差。用甲醇和水比例(46∶44)結(jié)果峰形對(duì)稱，分離好且分析時(shí)間縮短。

3.3二十五味珊瑚丸中同時(shí)含β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚，是藏菖蒲發(fā)揮藥效的重要指標(biāo)成分。目前國(guó)內(nèi)無(wú)β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚標(biāo)準(zhǔn)品，國(guó)外購(gòu)進(jìn)的純度較低[8]，β-細(xì)辛醚對(duì)照品色譜圖顯示含β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚兩種成分，但是樣品中α-細(xì)辛醚的含量低，故未建立α-細(xì)辛醚的含量測(cè)定方法。

3.4由于藏菖蒲藥材產(chǎn)地、年限、采收季節(jié)等因素不同，β-細(xì)辛醚含量明顯不同。同時(shí)結(jié)合78批次樣品含量測(cè)定結(jié)果，考慮該藥品存放時(shí)間、生產(chǎn)工藝穩(wěn)定對(duì)β-細(xì)辛醚含量影響等因素，暫訂本品每1g含藏菖蒲以β-細(xì)辛醚計(jì)，應(yīng)為0.40～2.20mg。

3.5對(duì)全國(guó)8家生產(chǎn)企業(yè)涉及的78批次的二十五味珊瑚丸進(jìn)行了β-細(xì)辛醚的含量測(cè)定，范圍在0.30～2.20 mg/g之間，表2可以看出西藏甘露生產(chǎn)(批號(hào)：14125A)的二十五味珊瑚丸中β-細(xì)辛醚的含量最高，比由西藏藏醫(yī)學(xué)院生產(chǎn)(140701)的高6倍，說明不同生產(chǎn)企業(yè)的該藥品β-細(xì)辛醚含量差異較大，含量較低難以保證藥效，故建議現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)增加β-細(xì)辛醚的含量測(cè)定以便控制該藥品質(zhì)量。

綜上，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法對(duì)藏藥二十五味珊瑚丸的質(zhì)量進(jìn)行了評(píng)價(jià)，并對(duì)建立的方法進(jìn)行了詳盡的方法學(xué)考察，為二十五味珊瑚丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，可作為二十五味珊瑚丸的質(zhì)量控制方法。

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(編輯：程鵬飛)

Content Determination of β-asarone in Tibet Traditional Medicine Ershiwuwei Shanhu Pills by HPLC

LAN JunA Ping

Tibet Institute for Food and Drug Control, Lhasa 850000, China

Objective To establish a UPLC determination method for β-asarone in Ershiwuwei Shanhu Pills. Methods The chromatogram column was Waters Xselect CSH C18(4.6mm×250mm,5μm), the mobile phase consisted of methanol-water (20∶80) and the flow rate was 1mL/min. The detection wavelength was 254nm and the column temperature was 35℃. Results The linear range of β-asarone was 0.4963～2.9778μg,r=0.9999. The average recovery rate was 99.27%,RSD%=1.1%. Conclusion The method is accurate, reliable, fast, sensitive, and suitable for quality control of Tibet traditional medicine Ershiwuwei Shanhu Pills.

Ershiwuwei Shanhu Pills; β-Asarone;HPLC;Content Determination

2016-06-15

蘭鈞(1984-)，女，漢族，本科學(xué)歷，主管藥師，主要從事藥品檢驗(yàn)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂工作。E-mail:623793676@qq.com

R291.408

A

1007-8517(2016)17-0008-03