湖南中醫(yī)藥高等?？茖W校（412012）劉起勝

湖南中醫(yī)藥大學（410007）成紹武 廖君 黃娟 葛金文

目前，已有研究顯示線粒體鐵蛋白（MtFt）與眾多神經(jīng)變性疾病有密切關(guān)系[1]，如不凝腿綜合征、帕金森癥以及遺傳性家族共濟失調(diào)等。本研究特進行相關(guān)大鼠實驗后報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 60只雄性大鼠由湖南醫(yī)科大學動物實驗中心提供，重量200～220g，許可證號SCXK（湘）2008-2002。

1.2 模型制備 模型組大鼠注射0.35g/kg劑量10%水合氯醛麻醉，后固定于I-C型腦立體定位儀上，常規(guī)消毒后切開皮膚，充分暴露前囟，參考大鼠腦立體定位圖譜確定海馬CA2區(qū)具體位置，后沿著垂直方向兩側(cè)埋植套管針，深度約24mm。1周后微量注射針對模型組大鼠兩側(cè)各推注Aβ寡聚體5ul，1次/d，連續(xù)3d。所有大鼠均為清潔級飼養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 樣本制備 切取大鼠海馬CA2區(qū)，①樣本于PBST液中清洗3遍，清洗時間5min/次。②將0.5%雙氧水、PBST液混合，后置入樣本浸泡約30min；取出樣本重復(fù)①。③將PBST液、MtFt單克隆抗體混合，將后者稀釋10倍；置入樣本于4℃孵育16h。樣本取出重復(fù)①。④用PBST液將生物素化后的IgG抗體稀釋1000倍，后置入樣本室溫孵育1h，取出切片樣本重復(fù)①。⑤應(yīng)用PBST液將ABC試劑3000倍稀釋，后置入樣本常溫孵育1h，取出切片樣本重復(fù)①。⑥取500ul0.01g/ml的DAB液、3.75ul30%的雙氧水、1ml7%的鎳離子液以及25mlTris-HCl液制成混合液，后置入樣本，待其變色后加入Tris-HCl溶液以終止反應(yīng)。⑦取出樣本置于載玻片后置干燥板上干燥。⑧將干燥好的樣本用乙醇液脫水，后將樣本放入二甲苯內(nèi)浸泡5min，后蓋上蓋玻片。

1.3.2 real-time PCR 首先分別提取樣本中RNA，制備cRNA。real-time PCR反應(yīng)流程為：25℃10min，48℃30min，95℃5min，25℃10min。整個反應(yīng)連續(xù)進行25個循環(huán)。

1.4 數(shù)據(jù)處理 SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計，計量資料“±s”表示，用t檢驗，P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 樣本染色結(jié)果 經(jīng)切片觀察顯示，AD大鼠海馬CA2區(qū)MtFt數(shù)量及密度均顯著高于正常大鼠。

2.2 real-time PCR法檢測情況（見附圖）。IMR-32分別加入轉(zhuǎn)染試劑、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒、MtFt質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染有MtFt的IMR-32細胞中mRNA表達量顯著降低，P＜0.01差異顯著。

附圖 real-time PCR法檢測情況

3 討論

鐵作為生命體不可或缺的一種金屬元素，具有維持細胞正常功能的作用，參與了腦組織中重要代謝過程。線粒體是細胞電子傳遞以及能量代謝最為旺盛的細胞器，而細胞所攝取的大部分鐵都需進入到線粒體內(nèi)參與相關(guān)代謝過程。

相關(guān)研究顯示，MtFt的結(jié)構(gòu)、功能與胞漿中鐵蛋白有高度同源性，且其可能具有調(diào)節(jié)線粒體穩(wěn)態(tài)，保護線粒體免受應(yīng)激損傷，對血紅素、鐵硫基團合成等方面的調(diào)節(jié)作用。本研究通過建立AD大鼠模型發(fā)現(xiàn)，MtFt在腦組織神經(jīng)元內(nèi)廣泛存在，但通過對AD模型大鼠海馬CA2區(qū)我們發(fā)現(xiàn)，模型組MtFt數(shù)量及密度均顯著高于對照組大鼠。說明MtFt在AD所致的病理狀態(tài)變化下表達量明顯增加。同時，本研究還顯示轉(zhuǎn)染有MtFt的IMR-32細胞中mRNA表達量顯著降低。說明MtFt能夠改善Aβ所致的炎癥反應(yīng)，對細胞具有一定保護作用。這提示MtFt對AD病變時炎性反應(yīng)損傷有保護作用，有助于抵抗細胞早期凋亡。

綜上，AD病變發(fā)生后MtFt表達量顯著升高，而MtFt對AD所致炎癥反應(yīng)具有一定保護作用。