邢建華，薄 惠，張 強(qiáng)

(黃河科技學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450063)

分子印跡(Msolecular Imprinted,MI)技術(shù)是從高分子聚合物領(lǐng)域發(fā)展而來的一項(xiàng)分子特異性識別技術(shù)，利用模板分子在印跡聚合物上形成空穴，對印跡分子產(chǎn)生特異性識別，當(dāng)印跡分子再次遇到模板分子時就能夠?qū)δ０宸肿赢a(chǎn)生特異性吸附。目前，MI技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用到藥物分離分析[1]、牛奶中三聚氰胺的檢測[2]、薰衣草精油中樟腦的提取[3]、瓜果蔬菜中殘留農(nóng)藥的檢測[4]等方面，但在DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子的測定方面研究較少。

經(jīng)典的蛋白質(zhì)測定方法主要有Lowry法[5]、Bradford法[6]及溴酚藍(lán)法[7]等，這些方法存在靈敏度低或線性范圍窄等缺點(diǎn)。近年來，建立了一些測定蛋白質(zhì)的新方法，如分光光度法[8 - 10]、熒光光度法[11,12]、化學(xué)發(fā)光法[13,14]、分子探針熒光光譜法[15]及共振光散射法[16]等。人尿中的蛋白質(zhì)含量測定是慢性腎炎、紫癜性腎炎、狼瘡性腎炎、糖尿病腎病等典型的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。因此制備牛血清白蛋白分子印跡模板，進(jìn)行吸附-解吸，去除人尿中的共存干擾物質(zhì)，建立人尿中蛋白質(zhì)的測定方法，具有十分重要的意義。本文以牛血清蛋白(BSA)為分子模板，甲基丙烯酸(MAA)為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDGMA)為交聯(lián)劑，偶氮二異丁腈(AIBN)為引發(fā)劑制備的BSA分子印跡模板，具有較強(qiáng)的選擇性，適用于復(fù)雜樣品中蛋白質(zhì)的分離分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

TU-1810型紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用)；HH-2恒溫水浴鍋(上海博訊)；AHS-1064烘箱(吳江華東標(biāo)準(zhǔn)烘箱公司)；pHS-3C型酸度計(jì)(上海儀田精密儀器有限公司)。

牛血清蛋白(BSA,美國Amresco公司,含量：98%)；甲基丙烯酸(MAA)、偶氮二異丁腈(AIBN)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDGMA)，均購于阿拉丁試劑有限公司，其余試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1BSA分子印跡模板的制備取0.5 g BSA于錐形瓶中，加入15 mL的乙酸∶甲醇(1∶1，V/V)混合溶液，超聲5 min溶解后，加入0.338 mL MAA，超聲10 min使其作用完全。最后加入6.93 mL EDGMA和20 mg AIBN混勻，通氮?dú)?5 min除氧，密封反應(yīng)容器，恒溫水浴鍋內(nèi)60 ℃反應(yīng)24 h后取出，將生成的聚合物研磨后過篩。取100目和200目之間的聚合物，用0.1 mol/L的NaOH溶液連續(xù)洗脫約12 h，至洗脫液用紫外法檢測不到BSA為止。洗脫后的聚合物用水和無水乙醇各洗三遍，晾干，備用。

1.2.2BSA印跡聚合物的吸附試驗(yàn)方法在100 mL 2 g/L的BSA水溶液中，加入1.00 g BSA印跡模板，吸附平衡后，于280 nm波長處測定吸光度，利用公式：Q=(c0-c1)V/m計(jì)算吸附容量。其中c0表示初始BSA的濃度(mg/mL),c1表示加入印跡分子之后的濃度(mg/mL)，V是BSA溶液的體積(mL)，m是加入印跡分子的質(zhì)量(g)。

1.2.3人尿中蛋白質(zhì)的測定方法取新鮮人尿20 mL,置干燥離心管中，以3 000 r/min離心20 min,精密吸取上清液5 mL，加入pH=5.2的緩沖溶液5 mL制成尿樣待測液，加入BSA分子印跡模板300 mg,吸附完全后，用pH=5.6的磷酸鹽緩沖溶液洗滌三次，每次10 mL，合并洗滌液于100 mL容量瓶中，定容。用紫外-可見分光光度計(jì)在280 nm波長處測定吸光度，代入工作曲線，計(jì)算蛋白質(zhì)含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 功能單體的選擇

分子印跡技術(shù)中常用的功能單體有丙烯酰胺、甲基丙稀酸、4-乙烯基吡啶等。實(shí)驗(yàn)分別以該三種功能單體制備了印跡模板，測定了三種模板對蛋白質(zhì)的吸附容量，結(jié)果分別為：12.8 mg/g、67.4 mg/g和34.7 mg/g。由結(jié)果可知，甲基丙烯酸作為功能單體制備的分子印跡模板吸附容量最大，因此選擇甲基丙烯酸作為蛋白質(zhì)分子印跡模板制備過程中的功能單體。

2.2 吸附時間的選擇

采用1.2.2方法，吸附一定時間后，測定吸光度值，結(jié)果示于圖1。由圖1可知，吸光度在120 min后變化較小，說明120 min時吸附到達(dá)平衡，因此，選擇吸附時間120 min。

2.3 pH值的影響

配制不同pH值的磷酸鹽緩沖溶液作為配制蛋白質(zhì)溶液的溶劑，考察不同pH值下蛋白質(zhì)印跡模板對蛋白質(zhì)的吸附作用。采用1.2.2方法測定了不同pH值下吸附后蛋白質(zhì)溶液的吸光度，結(jié)果示于圖2。由圖2可知，pH=5.6時吸光度值最大，表明此時吸附量最小；在pH值5.2時吸光度最小，表明此時吸附量最大。因此，pH=5.2磷酸鹽緩沖溶液適合作為吸附溶液，pH=5.6的緩沖溶液適合作為洗脫劑。

2.4 吸附溫度的選擇

采用1.2.2方法，考察了不同溫度下的吸附量，結(jié)果顯示，10～30 ℃吸附容量無明顯變化，高于30 ℃吸附容量下降，可能是溫度升高蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，所以測定在室溫下進(jìn)行即可。

2.5 吸附容量的考察

配制不同濃度的蛋白質(zhì)溶液，采用1.2.2方法測定蛋白質(zhì)分子模板對不同濃度蛋白質(zhì)溶液的吸附量，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，隨著蛋白質(zhì)溶液的濃度增大，吸附容量增大，最大吸附容量為72 mg/g。

2.6 工作曲線與檢測限

用pH=5.6的磷酸鹽緩沖溶液作為溶劑，配制一系列不同濃度的蛋白質(zhì)溶液。測定不同濃度蛋白質(zhì)溶液在280 nm波長處的吸光度A，以吸光度A對濃度c作圖，結(jié)果表明蛋白質(zhì)濃度在0.2022～2.022 mg/mL之間與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為：A=0.0111+0.587c相關(guān)系數(shù)為0.9997。檢測限為0.124 mg/mL。

2.7 干擾試驗(yàn)

配制2 g/L的人尿中可能存在的共存物質(zhì)溶液代替蛋白質(zhì)溶液，采用1.2.2方法進(jìn)行試驗(yàn)，其吸附容量示于表1。由表1可知，除半胱氨酸外，蛋白質(zhì)分子印跡模板對其它共存物質(zhì)無明顯吸附，雖然半胱氨酸的吸附容量較大，但半胱氨酸在280 nm處無明顯的吸收，所以對測定結(jié)果的準(zhǔn)確度無影響。

表1 選擇性試驗(yàn)

2.8 樣品的測定與回收率

按1.2.3方法取樣測定，并用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行對照，結(jié)果見表2。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行回收率試驗(yàn)，結(jié)果見表3。由表2、表3可知，本文所建立的方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

表2 人尿中蛋白質(zhì)測定結(jié)果(n=5)

表3 回收率試驗(yàn)(n=5)

3 結(jié)論

合成了蛋白質(zhì)分子印跡模板，并用它吸附人尿中的蛋白質(zhì)，洗脫后進(jìn)行測定。結(jié)果表明，該方法成功地除去共存的干擾物質(zhì)，具有測定專屬性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確度較高等特點(diǎn)。該方法用于人尿中蛋白質(zhì)的測定，結(jié)果滿意。