李經(jīng)緯，丁紫榮，余樂洹,3，劉小燕，王美歡，莊 僖，任明忠*，劉 珊

(1.長安大學(xué)，旱區(qū)地下水文與生態(tài)效應(yīng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710064；2.環(huán)境保護(hù)部華南環(huán)境科學(xué)研究所，廣東廣州 510655；3.廣東第二師范學(xué)院，廣東廣州 510303)

近年來，隨著抗生素生產(chǎn)量和使用量的迅猛增長，產(chǎn)生的藥物殘留及代謝產(chǎn)物持續(xù)不斷的進(jìn)入水體中，可能會(huì)在水環(huán)境中富集，使水中細(xì)菌抗藥性增強(qiáng)，生物致畸突變，對(duì)人體健康和當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境產(chǎn)生不可預(yù)測的危害[1,2]。目前已經(jīng)從多種水環(huán)境中檢出抗生素類藥物[3 - 6]。由于抗生素在環(huán)境中分布復(fù)雜，含量很低，水環(huán)境中通常是ng/L～μg/L級(jí)的濃度水平。因此，抗生素類物質(zhì)的檢測方法不僅要有良好的抗干擾性，同時(shí)對(duì)于低濃度的檢測還需要較強(qiáng)的靈敏性和量化性[7 - 10]。近幾年高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)及氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)等新技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用，更使精確定性定量環(huán)境中抗生素類藥物變?yōu)榭赡躘11 - 13]。但是這些方法大都是針對(duì)某幾種或某一類化合物，不適用于復(fù)雜基質(zhì)的分析檢測。

在廣東地區(qū)關(guān)于抗生素在水環(huán)境中檢測分析的研究較多，如唐才明等[14]在海水和城市污水中檢出多種磺胺和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，海水中磺胺甲惡唑?yàn)?6.5 ng/L，污水中磺胺類為29.2～468 ng/L；徐維海等[ 15]在珠江廣州河段水體中檢出氟喹諾酮和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，其質(zhì)量濃度分別為70.0～489 ng/L和13.0～69.0 ng/L。葉計(jì)朋等[ 16]在珠江三角洲主要水體深圳灣中檢出磺胺類抗生素為23.0～248 ng/L，維港中檢出氧氟沙星為10.0～16.0 ng/L。本文針對(duì)水環(huán)境中存在的大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類、甲氧芐啶、四環(huán)素類、氟喹諾酮類五類17種抗生素類物質(zhì)，建立了同時(shí)檢測不同性質(zhì)抗生素類藥物的HPLC-MS/MS方法。為環(huán)境中抗生素類物質(zhì)污染的特征研究提供一種快速、準(zhǔn)確的測定方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑與材料

羅紅霉素(RTM)、脫水紅霉素(ETM-H2O)、三乙酸朱桃霉素(ODM)、磺胺甲惡唑(SMX)、磺胺吡啶(SPD)、磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺二甲嘧啶(SMZ)、甲氧芐啶(TMP)、氧四環(huán)素(OTC)、四環(huán)素(TC)、氯四環(huán)素(CTC)、強(qiáng)力霉素(DC)、諾氟沙星(NFX)、氧氟沙星(OFX)、環(huán)丙沙星(CFX)、洛美沙星(LFX)、恩氟沙星(EFX)五類17種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品及7種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)13C-D3-紅霉素(ETM-13C-D3)、D4-磺胺甲惡唑(SMX-D4)、磺胺甲嘧啶(SMR)、D3-甲氧芐啶(TMP-D3)、D4-賽本咪唑(TBD-D4)、磺基水楊酸甲氯環(huán)素(MC)、D8-環(huán)丙沙星(CFX-D8)，均購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。將上述17種目標(biāo)物及7種內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解，配制成20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18 ℃避光保存。使用時(shí)用甲醇依次將17種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液混合稀釋成500 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，將7種內(nèi)標(biāo)混合稀釋成500 ng/mL內(nèi)標(biāo)工作液。甲醇(上海霍尼韋爾貿(mào)易有限公司)；甲酸(北京迪馬科技有限公司)；乙酸銨(上海西格瑪奧德里奇有限公司)；H2SO4、HCl(衡陽凱信化工試劑有限公司)；Na2EDTA(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

0.22 μm尼龍濾膜(廣州國凌儀器有限公司)；0.45 μm、200 mm的玻璃纖維濾膜(上海昀冠生物科技有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260 Infinity快速液相色譜(美國，Agilent)-AB 4000Q trap串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜(美國，AB SCIEX)聯(lián)用儀；12位防交叉污染固相萃取儀(美國，Supelco公司)；MGS-2200氮吹濃縮儀(日本，EYELA公司)；SCQ-1000C超聲波清洗儀(上海聲彥)；隔膜真空泵(天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。Oasis HLB固相萃取柱(500 mg/6mL,美國Waters公司)；C18柱(廣州國凌儀器有限公司)；PEP柱(中國博納艾杰爾公司)。

1.3 液相色譜和質(zhì)譜條件

1.3.1色譜條件CORTECSTM C18柱(100×4.6 mm;2.7 μm)；流動(dòng)相：A為2%甲酸+2 mmol/L乙酸銨溶液，B為乙腈；梯度洗脫：0～6.0 min，10%～68%B；6～7.5 min，68%～95%B；7.5～7.6 min，95%～10%B，流速0.5 mL/min；進(jìn)樣體積10 μL；柱溫：45 ℃。

1.3.2質(zhì)譜條件電離方式：電噴霧離子源，正離子模式(ESI+)；噴霧電壓：5 500 V；多反應(yīng)離子監(jiān)測模式(MRM)檢測；入口電壓EP=10.00 V，碰撞室出口電壓CXP=11 V；各化合物優(yōu)化的保留時(shí)間、MRM離子對(duì)、碎裂電壓、碰撞能量見表1。

1.4 樣品采集與前處理

用1 L棕色玻璃瓶采集水樣后，立即加入50 mL色譜純甲醇助溶，用稀H2SO4將pH調(diào)至3.0，水樣置于4 ℃冰盒中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室冷庫保存，并在48 h內(nèi)進(jìn)行前處理。水樣過200 mm玻璃纖維濾膜后加入0.5 g Na2EDTA，再加入100 μL 500 ng/mL的7種混合內(nèi)標(biāo)工作液，使其濃度達(dá)到50 ng/L，混合均勻后靜置30 min。依次用10 mL甲醇和超純水活化Oasis HLB固相萃取柱，最后加入2 mL稀HCl(pH=3.0)對(duì)柱子進(jìn)行酸化。以10 mL/min 速度加載水樣通過Oasis HLB柱。加載完畢后用10 mL超純水清洗小柱，以去除Na2EDTA和與小柱結(jié)合疏松的雜質(zhì)，然后在抽真空條件下，干燥1.5 h以去除殘留的水分。最后用12 mL甲醇進(jìn)行洗脫，洗脫液收集于15 mL具塞玻璃刻度離心管中。將洗脫液氮吹至近干，用1 mL甲醇定容后，渦旋混勻，過0.22 μm濾膜后，貯存于棕色進(jìn)樣瓶中，在-18 ℃下保存待檢。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)比較了乙腈和甲醇作為流動(dòng)相的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，基線更為穩(wěn)定。同時(shí)比較了1%～3%不同體積比的甲酸溶液作為流動(dòng)相的效果，結(jié)果表明2%甲酸+2 mmol/L乙酸銨溶液作為流動(dòng)相時(shí)，靈敏度最高，分離效果最佳。實(shí)驗(yàn)最終選定2%甲酸+2 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈作為流動(dòng)相，7 min內(nèi)7種內(nèi)標(biāo)物及所對(duì)應(yīng)的17種目標(biāo)化合物得到良好的分離。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將17種抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣，首先用全掃描模式找出分子離子峰，然后以分子離子峰為母離子，對(duì)其進(jìn)行轟擊以獲得二次碎裂產(chǎn)生的子離子。將分子離子和2個(gè)響應(yīng)適宜的子離子組成檢測離子對(duì)，以MRM模式進(jìn)行定性和定量分析，在此基礎(chǔ)上重點(diǎn)優(yōu)化對(duì)靈敏度影響較大的碰撞能量和碎裂電壓，從而獲得豐度和比例達(dá)到最高的特征離子。7種內(nèi)標(biāo)物及所對(duì)應(yīng)的17種目標(biāo)化合物優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 17種抗生素定性定量離子

Note:IS represents the internal standard; X corresponds to quantitative ion; Y corresponds to qualitative ion.

2.3 固相萃取條件的選擇和優(yōu)化

2.3.1固相萃取柱的選擇實(shí)驗(yàn)對(duì)比研究了C18、PEP、Oasis HLB 3種固相萃取小柱對(duì)空白水樣加標(biāo)的萃取回收率。圖1表明PEP小柱與Oasis HLB小柱對(duì)17種抗生素均具有良好的回收效果，但Oasis HLB小柱的回收效果(61.5%～125%)普遍優(yōu)于PEP小柱回收效果(39.9%～122%)，NFX、OFX、CFX、EFX四種氟喹諾酮類的抗生素在Oasis HLB柱上回收明顯高于PEP小柱，而C18小柱除對(duì)于這五種化合物的回收效果不好外，對(duì)RTM、SMZ、TC的回收效果亦不佳，可能是C18的填料對(duì)于這些化合物吸附性較強(qiáng)，難以洗脫或是這些物質(zhì)極性較強(qiáng)而對(duì)其沒有吸附效果，造成回收效果不理想。綜上所述，最終選擇Oasis HLB固相萃取小柱。

2.3.2洗脫溶劑的選擇實(shí)驗(yàn)對(duì)比了丙酮、二氯甲烷、乙腈、甲醇四種溶劑的洗脫效果。結(jié)果表明，丙酮、二氯甲烷、乙腈、甲醇四種溶劑對(duì)五種磺胺類化合物(SMX、SPD、SDZ、SMZ、TMP)洗脫能力相當(dāng)；丙酮、乙腈、甲醇三種溶劑對(duì)三種四環(huán)素類化合物(OTC、TC、CTC)洗脫能力也相差不大，回收率均大于80%；丙酮和乙腈對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(RTM、ETM-H2O、ODM)和氟喹諾酮類(NFX、OFX、CFX、LFX、EFX)洗脫回收效果稍差，二氯甲烷對(duì)TSETM、ODM、OTC和五種氟喹諾酮類洗脫回收效果很差，有的幾乎為零，反映出這些物質(zhì)可能很難溶于二氯甲烷。大環(huán)內(nèi)酯類回收率整體不高可能是在水相中溶解度較大，在固相中不易保留[17]。甲醇對(duì)17種抗生素的回收率都比較好，回收率范圍為62.1%～124%。因此，實(shí)驗(yàn)選取甲醇作為洗脫溶劑。

2.3.3洗脫溶劑的用量選擇提高洗脫劑體積有助于抗生素的洗脫，分別以8、10、12、14、16 mL甲醇為洗脫溶劑。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甲醇洗脫體積大于12 mL后，回收率趨于平衡。因此確定洗脫溶液的最佳體積為12 mL。

2.4 精密度及回收率實(shí)驗(yàn)

2.4.1基質(zhì)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)用超純水進(jìn)行空白基質(zhì)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，按照10、100 ng/L的質(zhì)量濃度加標(biāo)后進(jìn)行前處理,每個(gè)濃度平行4份，1份空白對(duì)照。17種抗生素的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差如表2所示。由表2可見，該方法有較好的重復(fù)性及準(zhǔn)確性，符合環(huán)境中抗生素類物質(zhì)分析的要求。

2.4.2線性關(guān)系與方法檢測限配制目標(biāo)物濃度為0.5、1、2.5、5、10、25、50、100和250 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，根據(jù)子離子定量分析，17種抗生素線性相關(guān)系數(shù)R2>0.990。方法的檢測限以3倍信噪比(S/N=3)進(jìn)行計(jì)算為0.01～2.50 ng/L(表2)。

表2 目標(biāo)物的檢測限、標(biāo)準(zhǔn)曲線、回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=4)

2.5 實(shí)際樣品測定

采用本文建立的方法對(duì)廣州市某河流上、下游兩段各采集6份水樣進(jìn)行測定，由表3可見，除ODM、CTC、LFX、EFX在上游段未檢測出，在下游段微量檢測出外，其余13種抗生素均有不同濃度的檢出。其中，檢出大環(huán)內(nèi)酯類抗生素為3.39～32.5 ng/L,磺胺類抗生素為19.9～335 ng/L，四環(huán)素類抗生素的質(zhì)量濃度為0～560 ng/L，氟喹諾酮抗生素0～151 ng/L。

表3 水樣中抗生素的濃度

ND:not detected.

3 結(jié)論

本文采用固相萃取，結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù),建立了一種對(duì)水中五類17種抗生素同時(shí)檢測的分析方法，該方法檢測限低、回收率高、重復(fù)性好，適合同時(shí)檢測水體中的多種抗生素類污染物，可滿足水環(huán)境樣品中目標(biāo)物的分析。