粟有志，劉 俊，李艷美，馬志愿，雷紅琴，羅 瓊

(1.伊犁出入境檢驗檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心，新疆伊寧 835000；2.新疆出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心，新疆烏魯木齊 830063；3.伊犁師范學(xué)院化學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，新疆伊寧 835000)

合成色素具有色澤鮮艷、著色力強、色調(diào)多樣等優(yōu)點，但它也存在毒性、致瀉性和致癌性等缺點[1]。世界各國對合成色素的使用范圍和限量都做出了嚴(yán)格的規(guī)定，我國國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 2760-2014)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》僅允許莧菜紅、胭脂紅、赤蘚紅、檸檬黃等11種合成色素在食品中限量使用[2]。優(yōu)質(zhì)枸杞呈現(xiàn)自然紅色，價格較高，是我國重要的食藥材，為防止不法商家在劣質(zhì)枸杞中添加合成色素以次充好、以壞充優(yōu)，建立枸杞中合成色素的檢測方法意義重大。

國內(nèi)外對合成色素的檢測方法主要有分光光度法[3,4]、薄層色譜法[5,6]、毛細(xì)管電泳[7,8]、脈沖極譜法[9]、液相色譜法[10 - 12]和液相色譜-質(zhì)聯(lián)用法[13 - 16]。其中，分光光度法和脈沖極譜法一般適合用于較為簡單的樣品，對復(fù)雜樣品無法進行準(zhǔn)確定性定量；薄層色譜法、毛細(xì)管電泳、液相色譜法不能對目標(biāo)分析物進行確證；液相色譜-質(zhì)譜法具有靈敏度高，抗基體干擾能力強等優(yōu)點，已成功應(yīng)用于食品中合成色素的測定。采用液相色譜-質(zhì)譜法分析合成色素，常見于糖果、飲料、紅酒等樣品，而枸杞中合成色素的檢測方法鮮有報道。本文以4種常用食品添加劑(誘惑紅、胭脂紅、赤蘚紅、莧菜紅)和5種工業(yè)染料(酸性紅1、酸性紅9、酸性紅14、酸性紅52、酸性紅73)為研究對象，采用固相萃取前處理降低樣品基質(zhì)干擾，成功地建立了枸杞中上述9種紅色合成色素的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)分析方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

Agilent 1260-6460A高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國，Agilent公司)，配有電噴霧離子源(ESI)；EYELA MMV-1000 W振蕩器(日本，東京理化公司)；N-EVAP-112水浴氮吹儀(美國，Organomation公司)；Sigma3-18K臺式冷凍離心機(美國，Sigma公司)；T18基本型均質(zhì)器和MS3型渦旋振蕩器(德國，IKA公司)。Strata-X-AW固相萃取柱(60 mg/3mL，Phenomenex公司)；Oasis HLB、Oasis WAX、Oasis MAX固相萃取柱(均為60 mg/3mL，Waters公司)；Plexa PAX固相萃取小柱(60 mg/3mL，Agilent公司)。

9種色素標(biāo)準(zhǔn)品均購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，純度均大于98.0%。 準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品10 mg(精確至0.01 mg)于10 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，儲存于4 ℃冰箱中備用。乙腈、丙酮、甲酸、乙醇、甲醇均為色譜純，其他試劑為分析純。實驗用水為Milli-Q超純水。

實驗所用枸杞樣品來自市場隨機采樣和送檢樣品。

1.2 樣品前處理

取代表性樣品500 g，置于混合研磨儀中充分粉碎，密封，儲存于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。稱取試樣1 g(精確至0.01 g)于50 mL具塞離心管中，加入20 mL乙腈-甲醇(5∶5，V/V)，10 000 r/min均質(zhì)1 min，10 000 r/min離心10 min，上清液備用。Oasis WAX固相萃取柱依次用3 mL甲醇、3 mL水預(yù)先活化；吸取上清液10 mL于試管中在40 ℃水浴下氮吹至干，用6 mL水分兩次超聲溶解殘渣，將溶解液全部轉(zhuǎn)移至Oasis WAX柱中，棄去流出液，依次用3 mL水、3 mL甲醇淋洗小柱，棄去淋洗液，于負(fù)壓下抽干萃取柱，最后用6.0 mL氨水-甲醇(5∶95,V/V)洗脫，收集洗脫液于15 mL試管中，于40 ℃水浴下氮吹至干，用1 mL乙腈-水(1∶9,V/V)復(fù)溶。將復(fù)溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，15 000 r/min離心10 min，上清液供HPLC-ESI-MS/MS測定。

1.3 液相色譜與質(zhì)譜條件

1.3.1液相色譜條件色譜柱：Zorbax Eclipse Plus C18柱(100×3.0 mm,1.8 μm)；柱溫：30 ℃；進樣量：10.0 μL；流動相：10 mmol/L乙酸銨溶液(A)和乙腈(B)，流速0.3 mL/min；梯度洗脫程序：0～1.0 min，10%B；1.0～5.5 min，10%～90%B；5.5～7.5 min，90%B；7.51～12.0 min，90%B。

1.3.2質(zhì)譜條件電離模式：負(fù)離子源模式(ESI-)；多重反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)檢測；霧化氣、鞘氣、碰撞氣均為高純氮氣；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流量：9.0 L/min；鞘氣溫度：250 ℃；鞘氣流速：11.0 L/min；毛細(xì)管電壓:3.5 kV。9種色素的監(jiān)測離子對、碰撞能力、碎裂電壓等詳見表1。

表1 9種紅色合成色素的質(zhì)譜分析參數(shù)

CE:collision energy;F:fragmentor voltage;* quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

9種紅色合成色素均為弱酸性化合物，適合于負(fù)離子掃描模式。配制9種色素單一標(biāo)準(zhǔn)溶液；在不接色譜柱的條件下進行母離子全掃描，確定準(zhǔn)分子離子峰。參照歐盟指令657/2002/EEC決議中有關(guān)規(guī)定，本文選擇離子豐度最高、本底干擾最小的兩個離子對作為特征離子對，其中信號較大的離子對作為定量離子?；趦?yōu)化結(jié)果建立的質(zhì)譜條件參數(shù)詳見表1。

比較不同濃度的甲酸、乙酸銨、甲酸-乙酸銨水溶液、純水所組成的無機相，乙腈、甲醇組成的有機相系統(tǒng)。通過不同無機相與有機相的組合比較分析發(fā)現(xiàn)，乙腈-10 mmol/L乙酸銨水溶液為流動相時，9種色素的離子化效益較好。通過設(shè)定梯度洗脫程序，9種色素均可獲得較好的分離度和響應(yīng)信號。

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1提取溶劑的選擇9種色素均為極性化合物，實驗比較了水、甲醇、乙腈、丙酮、乙醇5種極性溶劑對目標(biāo)物的提取效率。結(jié)果如圖1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈-甲醇(5∶5,V/V)提取時9種色素的提取回收率均可到達檢測要求。

2.2.2固相萃取柱及洗脫劑的選擇取9種色素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液3 mL分別過60 mg/3mL的Oasis WAX、Plexa PAX、Strata-X-AW、Oasis MAX、Oasis HLB固相萃取柱，收集流出液，供HPLC-MS/MS測試。結(jié)果表明，帶有陰離子交換基團的Oasis WAX、Strata-X-AW、Plexa PAX、Oasis MAX均可以對9種色素完全吸附。

分別采用氨水-甲醇(5∶95,V/V)、甲酸-甲醇(5∶95,V/V)、鹽酸-甲醇溶液(0.5∶99.5,V/V)、乙腈、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯各10 mL為洗脫液對Oasis WAX、Strata-X-AW、Plexa PAX、Oasis MAX固相萃取柱進行洗脫。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10 mL氨水-甲醇可將Oasis WAX和Strata-X-AW固相萃取柱吸附的色素完全洗脫。在枸杞樣品中添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進一步對比Oasis WAX和Strata-X-AW固相萃取對樣品的凈化效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二者凈化樣品時，9種色素的實驗回收率均可滿足分析的要求，但Oasis WAX固相萃取柱凈化，樣品的基質(zhì)干擾相對較小。故本文選擇Oasis WAX固相萃取柱凈化樣品。

以氨水-甲醇(5∶95,V/V)為洗脫液，進一步優(yōu)化洗脫液的用量，每2 mL洗脫液收集一次，共收集12 mL。分別計算各段流出液中色素的回收率。結(jié)果表明，洗脫液體積大于6 mL時回收率在80%～110%的色素的個數(shù)不再增加，平均回收率也無明顯提高。故本文最終選擇6 mL氨水-甲醇進行洗脫?？瞻讟悠泛吞砑訚舛葹?倍定量限(LOQ)的9種紅色合成色素的空白樣品，經(jīng)提取和凈化后的MRM色譜圖見圖2。

2.3 方法的線性關(guān)系、檢出限和定量限

實驗發(fā)現(xiàn)，樣品基質(zhì)對9種分析色素均有一定的抑制作用，本文采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線以消除樣品基質(zhì)效應(yīng)。陰性樣品按照1.2節(jié)條件凈化后，將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適當(dāng)稀釋，配成合適濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。以峰面積(y)對合成色素的質(zhì)量濃度(x)作線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，9種色素在枸杞基質(zhì)中的相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.992。以信噪比(S/N)≥3確定方法的檢出限(LOD)，其范圍為0.003～0.900 mg/kg；以S/N≥10確定方法的定量限(LOQ)，其范圍為0.01～3.00 mg/kg。9種紅色合成色素的保留時間、線性關(guān)系、檢出限和定量限詳見表2。

表2 9種紅色合成色素的保留時間、線性關(guān)系、檢出限和定量限

(續(xù)表2)

2.4 方法的準(zhǔn)確度和精密度

選擇枸杞空白樣品，以1、2、10 倍LOQ為加標(biāo)水平進行回收率實驗。添加中間混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的樣品，靜置30 min，待色素被樣品充分吸收后，按照1.2節(jié)方法和1.3節(jié)條件進行前處理和儀器測定，每個水平重復(fù)6次。實驗回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。從表3可以看出，9種紅色合成色素的回收率為82.4%～99.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.6%～16.1%。

表3 9種紅色合成色素的添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.5 樣品測定

利用本方法對市售的50份枸杞樣品進行9種紅色合成色素的測定，結(jié)果均未檢出目標(biāo)分析物。將陰性樣品浸泡在誘惑紅水溶液中過夜，撈出，置于烘箱中65 ℃烘干，獲得含有誘惑紅的枸杞陽性樣品，自制陽性樣品色譜圖見圖3。

3 結(jié)論

本文通過對儀器參數(shù)、提取溶劑、固相萃取條件的優(yōu)化，建立了枸杞中酸性紅1、酸性紅9、誘惑紅等9種紅色合成色素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。該方法定量限、回收率和精密度均滿足痕量分析的要求，可為枸杞中此類物質(zhì)的風(fēng)險監(jiān)控提供可靠的技術(shù)支持。