王秋峰，杜風(fēng)光，劉　鉞，喬建援，李　勇，王方方，劉　燕

（河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司，車用生物燃料技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南南陽473000）

采用響應(yīng)面法優(yōu)化高濃度發(fā)酵探究

王秋峰，杜風(fēng)光，劉鉞，喬建援，李勇，王方方，劉燕

（河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司，車用生物燃料技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南南陽473000）

高濃度發(fā)酵在當(dāng)下酒精發(fā)酵行業(yè)是勢在必行。實(shí)現(xiàn)高濃度發(fā)酵，在采用高效酵母的同時(shí)，控制主發(fā)酵期的溫度是很必要的。發(fā)酵溫度由34℃降低為32.5℃，酒精度將達(dá)到16%vol以上，總糖維持在生產(chǎn)要求的2.5%左右，通過響應(yīng)面法對高濃度發(fā)酵的條件進(jìn)行優(yōu)化，為生產(chǎn)提供參考和依據(jù)。

高濃度發(fā)酵； 響應(yīng)面法； 發(fā)酵溫控； 酒精

隨著國家減少碳排量目標(biāo)的制定，而汽車保有量的不斷增加，燃料乙醇工業(yè)緩解了石油資源短缺的問題，減輕了對進(jìn)口石油的依賴程度［1］。燃料乙醇是大勢所趨，但是我國的酒精發(fā)酵行業(yè)卻面臨如下問題：如原料供應(yīng)問題，按照規(guī)劃，到2020年我國的燃料乙醇目標(biāo)為1500 萬t，而對應(yīng)的糧食消耗為4200萬t，需要采用非糧作物如木薯、糖類和纖維質(zhì)等［2-3］生產(chǎn)酒精。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，我國酒精廠的發(fā)酵醪酒精含量與國外還是有一定的差距，提高酒精發(fā)酵罐的發(fā)酵能力，降低能耗、水耗，降低成本，最有效的途徑就是采用提高酒精濃度即濃醪發(fā)酵［5］。雖然濃醪發(fā)酵技術(shù)有許多好處，但是應(yīng)用過程還有許多問題需要解決，首先高濃度發(fā)酵需要耐高濃度、耐高溫以及耐高酒度的優(yōu)良菌株，其次要提高生產(chǎn)管控水平，對發(fā)酵過程溫度過高能夠及時(shí)有效地調(diào)節(jié)和管控。否則盲目提高濃度可能釀成生產(chǎn)事故。

本實(shí)驗(yàn)以天冠集團(tuán)與浙江大學(xué)合作選育的耐高酒精度、耐高溫與耐高濃度菌株作為菌種，結(jié)合生產(chǎn)車間原料為發(fā)酵醪，應(yīng)用降低開發(fā)成本、優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件、提高生產(chǎn)效率、有效的響應(yīng)面優(yōu)化法［6-9］對工藝進(jìn)行優(yōu)化，為生產(chǎn)提供參考和依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

菌種：天冠集團(tuán)實(shí)驗(yàn)中心高轉(zhuǎn)項(xiàng)目組實(shí)驗(yàn)室保藏。實(shí)驗(yàn)原料：木薯粉、玉米粉、A/B淀粉漿，燃料乙醇生產(chǎn)車間。

實(shí)驗(yàn)試劑：神舟糖化酶，酶活力100000 U/mL；諾維信液化酶，酶活力70000 U/mL；隆大酸性蛋白酶，酶活力50000 U/mL；尿素。

儀器設(shè)備：電熱恒溫水浴鍋，DK-S28，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，DHP-2010，華利達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器，ZHWY-211C，上海智城分析儀器制造有限公司；萬用電爐，DL-1北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

工藝流程：混合原料分組液化后再混合→稀釋一定量液化醪接菌種制作酒母→向成熟酵母中添加液化醪并且同步糖化發(fā)酵→蒸餾。

實(shí)驗(yàn)過程盡量模擬生產(chǎn)過程進(jìn)行。采用混合原料發(fā)酵（玉米、小麥、木薯），分組液化可以提高物料的利用率以及降低能耗，即將玉米與水按比例混合后，添加高溫液化酶以95～100℃液化2～3 h，木薯粉與小麥淀粉漿（小麥通過洗濾后制成的淀粉漿）混合后，添加高溫液化酶以90～95℃液化，冷卻后按一定比例混合。在實(shí)驗(yàn)室三角瓶搖床發(fā)酵，采用三角瓶中直接培養(yǎng)酒母，待培養(yǎng)成熟后（細(xì)胞數(shù)1億/mL，出芽率20%以上）向三角瓶中添加液化醪糖化酶進(jìn)行同步糖化發(fā)酵。

1.3分析方法

酒精度的測定、總酸的分析、外觀糖的測定、殘還原糖的測定、殘總糖的測定按文獻(xiàn)［10］方法進(jìn)行。

1.4高濃度發(fā)酵的單因素實(shí)驗(yàn)

1.4.1發(fā)酵濃度對酒精發(fā)酵的影響

將液化醪稀釋至物料濃度為25%，裝入1000 mL三角瓶中接種發(fā)酵菌落培養(yǎng)，培養(yǎng)成熟后，分別添加不同濃度的液化醪，使總發(fā)酵濃度分別為270 g/L、290 g/L、310 g/L，在32℃培養(yǎng)箱中搖動發(fā)酵，轉(zhuǎn)速為100 r/min，直至發(fā)酵結(jié)束（失重小于0.2 g/h），檢測其酒精度。重復(fù)3次，取其平均值。

1.4.2發(fā)酵溫度對酒精發(fā)酵的影響

將液化醪稀釋至物料濃度為25%，裝入1000 mL三角瓶中接種發(fā)酵菌落培養(yǎng)，培養(yǎng)成熟后，分別添加不同濃度的液化醪使總發(fā)酵濃度為290 g/L，分別在30℃、32℃、34℃溫度下發(fā)酵，培養(yǎng)箱中搖動發(fā)酵，轉(zhuǎn)速為100 r/min，直至發(fā)酵結(jié)束（失重小于0.2 g/h），檢測其酒精度。重復(fù)3次，取其平均值。

1.4.3發(fā)酵時(shí)間對酒精發(fā)酵的影響

將液化醪稀釋至物料濃度為25%，裝入1000 mL三角瓶中接種發(fā)酵菌落培養(yǎng)，培養(yǎng)成熟后，分別添加不同濃度的液化醪使總發(fā)酵濃度為290 g/L，發(fā)酵溫度為32℃，培養(yǎng)箱中搖動發(fā)酵，轉(zhuǎn)速為100 r/min，分別在60 h、66 h 和72 h檢測其酒精度。重復(fù)3次，取其平均值。

1.5高濃度酒精發(fā)酵的響應(yīng)面設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken模型選取發(fā)酵濃度、發(fā)酵溫度以及發(fā)酵時(shí)間作為響應(yīng)面法的考察因素。以酒精度作為響應(yīng)值，用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件Design-Expert 8.0設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，各因素的編碼與取值見表1。

表1　響應(yīng)面編碼與取值情況

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1發(fā)酵濃度對酒精發(fā)酵的影響（圖1）

由圖1可知，32℃時(shí)隨著濃度的升高，酒精產(chǎn)量不斷增加，當(dāng)濃度達(dá)到290 g/L后，酒精含量升高不顯著，而且隨著濃度升高，酒精產(chǎn)率反而降低，原因是酵母受到過高的糖濃度脅迫使發(fā)酵無法進(jìn)行。

2.1.2發(fā)酵溫度對濃醪酒精發(fā)酵的影響（圖2）

圖1　不同濃度原料發(fā)酵結(jié)果的影響

圖2　不同溫度對濃醪酒精發(fā)酵的影響

由圖2可知，發(fā)酵濃度為290 g/L，在28℃下發(fā)酵很緩慢，在64 h后發(fā)酵酒精度不高，隨著溫度升高，發(fā)酵速率加快，在一定時(shí)間內(nèi)物料得到更充分利用，但是隨著發(fā)酵溫度的升高，產(chǎn)酒精率不斷下降，是由于濃醪發(fā)酵勢必產(chǎn)生高濃度的酒精，高溫造成酒精對酵母的損害作用，而溫度的升高加劇了該損害作用使酵母大量死亡，發(fā)酵無法進(jìn)行。

2.1.3發(fā)酵時(shí)間對濃醪發(fā)酵的影響（圖3）

圖3　不同發(fā)酵時(shí)間對濃醪發(fā)酵的影響

由圖3可知，在發(fā)酵濃度為290 g/L、發(fā)酵溫度為32℃，發(fā)酵到72 h時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行而酒精度不斷上升，72 h后，隨著時(shí)間延長，生酸污染的風(fēng)險(xiǎn)增大而且延長時(shí)間不利于提高設(shè)備利用率。

2.2響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2）

2.3回歸模型的建立（表3）

通過統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert 8.0以酒精度為響應(yīng)值，對表2進(jìn)行多元回歸擬合，得出參數(shù)的初步回歸模型：

表2　響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果

剔除不顯著項(xiàng)，經(jīng)過優(yōu)化后回歸模型為：

表3　酒精度回歸模型方差分析

由表3可知，模型P值為0.0015表明回歸模型方程極顯著：失擬項(xiàng)0.4579＞0.05，表明不顯著，模型的校正決定系數(shù)為RADJ=0.9330，表明回歸模型與實(shí)測數(shù)值可以較好的擬合。變異系數(shù)（CV）表示實(shí)驗(yàn)的精確度，值越大，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠度越低，實(shí)驗(yàn)CV為1.67%在可接受范圍，表明此模型可以對酒精度結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。

回歸方程各變量系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，模型（1）的一次項(xiàng)中A-溫度、B-濃度影響極為顯著，C-時(shí)間影響不顯著，交互項(xiàng)都不顯著，二次項(xiàng)A2影響顯著。

2.4酒精發(fā)酵工藝優(yōu)化以及驗(yàn)證

通過Design-Expert軟件設(shè)計(jì)對高濃度發(fā)酵的溫度控制進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計(jì)的最適濃度為310 g/L，發(fā)酵溫度為30.70℃，發(fā)酵時(shí)間為68.3 h，預(yù)測酒度為16.44%vol，考慮到實(shí)際的生產(chǎn)控制情況，以及設(shè)備利用率，在進(jìn)行3組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)時(shí)將溫度調(diào)高到32.5℃，發(fā)酵濃度290 g/L，發(fā)酵時(shí)間64 h，發(fā)酵結(jié)果為酒度15.8%vol，比軟件預(yù)測的15.55%vol提高了1.6%vol，在國內(nèi)屬于先進(jìn)水平，可以將此發(fā)酵工藝設(shè)為最佳生產(chǎn)參數(shù)。

3　結(jié)論

高濃度發(fā)酵的前提條件是選育耐高酒、耐高溫與耐高濃度菌株作為菌種，天冠企業(yè)集團(tuán)通過與浙江大學(xué)合作選育優(yōu)良菌株［11］并且與生產(chǎn)緊密結(jié)合，使該企業(yè)的發(fā)酵酒度與原料利用率得到比較大的提高。

由于發(fā)酵溫度對微生物生命活動影響很大，發(fā)酵結(jié)果的好壞與溫控有密切關(guān)系，所以在進(jìn)行高濃度發(fā)酵時(shí)一定要做好溫控工作，可以選擇溫度較低的季節(jié)或者加大板冷以及打循環(huán)的強(qiáng)度。

通過Design-Expert軟件設(shè)計(jì)對高濃度發(fā)酵的溫度控制進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計(jì)的最適濃度為310 g/L，發(fā)酵溫度為30.70℃，發(fā)酵時(shí)間為68.3 h，預(yù)測酒度為16.44%vol，在考慮到實(shí)際的生產(chǎn)控制情況，將溫度調(diào)高到32.5℃，發(fā)酵濃度為290 g/L，發(fā)酵時(shí)間為64 h，發(fā)酵結(jié)果為酒度15.8%vol，比軟件預(yù)測的15.55%vol還提高了1.6%vol，結(jié)合實(shí)際的生產(chǎn)工藝管控以及管理水平，可以適當(dāng)降低發(fā)酵溫度同時(shí)調(diào)高發(fā)酵濃度，充分利用資源做到提高生產(chǎn)率、提高原料利用率、節(jié)能增效才是企業(yè)發(fā)展之道。

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Optimization of High-Concentration Fermentation by Response Surface Method

WANG Qiufeng，DU Fengguang，LIU Yue，QIAO Jianyuan，LI Yong，WANG Fangfang and LIU Yan
（State Key Lab of Motor Vehicle Biofuel Technology，He'nan Tianguan Enterprise Group Co.Ltd.，Nanyang，He'nan 473000，China）

High-concentration fermentation is imperative in alcohol fermentation industry at present.Except for the use of high-efficiency yeast，it is necessary to control the temperature during chief fermentation period.In the experiment，as fermentation temperature dropped from 34℃to 32.5℃，alcohol content would reach above 16%vol with total sugar content at around 2.5%，which met the requirements of the production.The optimization of high-concentration fermentation by response surface method provided reference for practical production.

high-concentration fermentation；response surface method；temperature control；alcohol

TS262.2；TS261.4

A

1001-9286（2016）09-0086-03

10.13746/j.njkj.2016170

2016-05-19

王秋峰（1983-），碩士研究生，工程師，研究方向：生物能源研究。