周　森，胡佳音，趙衛(wèi)鵬，劉紅霞，于曉濤，魏金旺

（北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠，北京101301）

高通量測序技術(shù)在航天大曲微生物多樣性中的應(yīng)用

周森，胡佳音，趙衛(wèi)鵬，劉紅霞，于曉濤，魏金旺

（北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠，北京101301）

太空搭載微生物已有多年歷史，因太空具有超真空、超潔凈、微重力、強(qiáng)輻射的特殊環(huán)境，可以引起染色體變異，導(dǎo)致表達(dá)性狀改變。牛欄山酒廠利用太空搭載技術(shù)將“牛欄山一號清香型低溫大曲”搭載神舟9號飛船，在太空遨游13 d，利用太空失重狀態(tài)以及太空射線等因素對酒曲微生物進(jìn)行誘導(dǎo)，采用免培養(yǎng)手段“高通量測序技術(shù)”對太空大曲和對照大曲進(jìn)行微生物多樣性分析。結(jié)果表明，大曲在航天飛行過程中，由于受到宇宙射線、高真空、弱磁場等多種環(huán)境因素的影響，改變了原有大曲中微生物的比例。

航天大曲； 對照大曲； 高通量測序

高通量測序技術(shù)是傳統(tǒng)測序技術(shù)一次革命性的改變，被稱為下一代測序技術(shù)，可以一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定，為環(huán)境樣品中微生物群落的多樣性研究提供了契機(jī)。通過對環(huán)境樣品DNA進(jìn)行大規(guī)模測序，可以得到涵蓋微生物群落中全部微生物的遺傳信息，從而獲得微生物群落組成。指導(dǎo)傳統(tǒng)微生物分離，獲得可靠的活體菌株，對篩選性狀突變菌起到指導(dǎo)作用。本研究采用高通量測序技術(shù)，從分子生物學(xué)層面全面解析“牛欄山一號清香型低溫大曲”在經(jīng)過太空遨游后的微生物比例關(guān)系，為太空大曲的微生物分離以及優(yōu)勢菌株篩選提供理論支撐。

1　材料與方法

1.1材料

牛欄山一號清香型低溫航天大曲，簡稱航天大曲；牛欄山清香型低溫大曲，簡稱對照大曲。

1.2主要儀器與試劑

德國Eppendorf公司1-14k高速冷凍離心機(jī)；美國BIORAD公司基礎(chǔ)型水平電泳儀；美國BIORAD公司全自動凝膠成像儀；美國MP FastPrep-24樣品快速制備系統(tǒng)。

1.3實驗方法

1.3.1高質(zhì)量DNA提取方法

稱取1 g混勻大曲樣品，用Fastprep處理后，采用土壤基因組DNA提取試劑盒（FastDNA SPIN Kit for Soil）提取并檢驗濃度（每個樣品提取3份DNA，確保DNA濃度）。

1.3.2高通量測序

通過Illumina平臺（Miseq）進(jìn)行Paired-end測序，測定真菌ITS1區(qū)和細(xì)菌16S V3—V4區(qū)，下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過預(yù)處理，去除低質(zhì)量reads（過濾標(biāo)準(zhǔn)：Q20≥90%）。之后用QIIME軟件進(jìn)行總體分析，利用軟件將序列相似性大于97%的定位為一個OTU（operational taxonomic units）。選取分析數(shù)據(jù)中每個OTU中一個有代表性的序列，通過進(jìn)行blast比對，獲得每一個OTU種名。

2　結(jié)果與分析

2.1DNA提取

將提取完成后的DNA進(jìn)行電泳檢測，Maker采用D2000檢驗（圖1）。

圖1　DNA提取電泳圖

通過圖1可以看出，航天大曲和對照大曲DNA樣品質(zhì)量較好，在15000BP處都出現(xiàn)明顯條帶。

2.2真菌高通量結(jié)果

航天大曲和對照大曲本次高通量測序共獲得124種真菌OTU，將數(shù)量在0.1%以上OTU進(jìn)行種名對比，其余OTU歸納為其他。

圖2　航天大曲真菌多樣性

圖3　對照大曲真菌多樣性

由圖2、圖3和表1可以看出，航天大曲和對照大曲的真菌微生物主體種類改變不大，但各種微生物所占比例有所變化。同對照大曲相比，航天大曲中的畢赤酵母（P.kudriavzevii）、異常維克漢姆酵母（W.anomalus）、發(fā)酵畢赤酵母（P.fermentans）、傘枝橫梗霉（L.corymbifera）、謝瓦散囊菌（E.chevalieri）所占比例均減少，而扣囊復(fù)膜酵母（S.fibuligera）所占比例增加，并且釀酒酵母（S.cerevisiae）和多變跟毛霉（R.variabilis）在航天大曲中并未檢測出。說明，在太空飛行過程中，大曲中真菌受外界宇宙射線、高真空、弱磁場等環(huán)境影響出現(xiàn)衰亡現(xiàn)象，不同的衰亡率造成了大曲真菌微生物比例的改變。

表1　對照大曲和航天大曲主要真菌OTU比例對比

2.3細(xì)菌高通量結(jié)果

航天大曲和對照大曲本次高通量測序共獲得666種細(xì)菌OTU，將數(shù)量在1%以上OTU進(jìn)行種名對比，其余OTU歸納為其他。

圖4　航天大曲細(xì)菌多樣性

圖5　對照大曲細(xì)菌多樣性

表2　對照大曲和航天大曲主要細(xì)菌OTU比例對比

通過以上高通量數(shù)據(jù)（圖4、圖5和表2）可以看出，大曲在經(jīng)歷太空飛行后，細(xì)菌種類并未出現(xiàn)大的變化，比例組成變化較大。同對照大曲相比，比例減少較多的主要有融合維斯氏菌（W.confusa）、彎曲乳桿菌（L.curvatus）、檸檬明串珠菌（L.citreum）、戊糖片球菌（P.pentosaceus）；比例增多的主要有地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）、耐酸乳桿菌（L.acetotolerans）。說明太空中的獨特環(huán)境同樣影響了大曲中細(xì)菌的存活率，不同種微生物的死亡數(shù)量改變了航天大曲中細(xì)菌的比例組成。

2.4結(jié)果分析

大曲中的真菌和細(xì)菌在經(jīng)歷過太空飛行后，由于太空中的宇宙射線、微重力、高真空、弱磁場等獨特環(huán)境，均出現(xiàn)了衰亡現(xiàn)象，而不同種微生物的衰亡數(shù)量引起了航天大曲的微生物比例組成發(fā)生變化。

在真菌方面，對照大曲的主體是扣囊復(fù)膜酵母占90%，余下的絲狀真菌和酵母所占比例不大，在經(jīng)歷太空飛行后，由于畢赤酵母、異常維克漢姆酵母、傘枝橫梗霉等出現(xiàn)大量衰亡，而扣囊復(fù)膜酵母未出現(xiàn)衰亡或者衰亡量較少，造成扣囊復(fù)膜酵母所占比例從90%增加到96%。

在細(xì)菌方面，對照大曲主要由芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和乳酸菌、融合維斯氏菌、檸檬明串珠菌、戊糖片球菌組成，占細(xì)菌總數(shù)的66%。在經(jīng)歷太空飛行后，多數(shù)乳酸菌所占的比例減少，而地衣芽孢桿菌比例由23%增加到40%，成為了航天大曲中的主體細(xì)菌。

3　討論

通過高通量實驗結(jié)果可以看出，大曲中的真菌和細(xì)菌在航天飛行過程中由于受到宇宙射線、高真空、弱磁場等環(huán)境因素的影響，均出現(xiàn)了不同程度的死亡，改變了原有大曲中微生物的比例。通過高通量測序技術(shù)，解析了經(jīng)歷太空飛行后大曲在與對照大曲之間的微生物種類組成及相應(yīng)的比例關(guān)系，對太空大曲的微生物分離起到指導(dǎo)作用。依據(jù)高通量測序數(shù)據(jù)，我們可以有目的地設(shè)計培養(yǎng)基，對航天大曲和對照大曲中微生物進(jìn)行分離鑒定。并且可以將微生物分離結(jié)果同高通量數(shù)據(jù)相互印證，從而獲得準(zhǔn)確結(jié)果及活體菌株，為下一步的太空誘變微生物的性能測定、篩選以及特色航天酒的生產(chǎn)打下堅實的基礎(chǔ)。

［1］喬曉梅，趙景龍，杜小威，等.高通量測序法對清香大曲真菌群落結(jié)構(gòu)的分析［J］.釀酒科技，2015（4）：28-31.

［2］唐婧，蘇迪，徐小蓉，等.基于宏基因組學(xué)的茅臺酒酒曲細(xì)菌的多樣性分析［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（11）：180-183.

［3］羅惠波，王彩虹，甄攀，等.基于ITS基因文庫法研究清香型大曲真菌群落結(jié)構(gòu)［J］.釀酒科技，2014（5）：31-35.

［4］馬凱，崔哲男，鄭曉衛(wèi)，等.汾酒大曲可培養(yǎng)真菌多樣性的初步分析［J］.中國釀造，2007（8）：19-21.

［5］楊濤，劉光燁，李文賓，等.太空酒曲中功能菌的生物酶活性研究［J］.釀酒，2003（6）：35-36.

［6］張彬，楊濤，管桂臻，等.釀酒微生物太空育種及在生產(chǎn)中的應(yīng)用研究（Ⅱ）芝麻香型白酒釀造功能微生物的太空育種［J］.釀酒，2014（6）：45-50.

［7］方曉梅，趙志甲，顧?？?泰樂菌素產(chǎn)生菌的空間誘變育種研究［J］.航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程，2005（2）：121-125.

［8］田海波.神九送“牛欄山”回家［J］.中國酒，2012（8）：26-27.

［9］張宗舟，謝亞萍.太空搭載對大曲微生物區(qū)系的影響［J］.食品科學(xué)，2009（3）：214-216.

［10］馬旭光，張宗舟.航天誘變高產(chǎn)單細(xì)胞蛋白啤酒酵母YB-6菌株的篩選［J］.中國飼料，2008（4）：42-44.

［11］溫賢芳，張龍，戴維序，等.天地結(jié)合開展我國空間誘變育種研究［J］.核農(nóng)學(xué)報，2004（4）：241-246.

［12］張玲華，田興山.微生物空間誘變育種的研究進(jìn)展［J］.核農(nóng)學(xué)報，2004（4）：73-75.

［13］劉振波.DNA測序技術(shù)比較［J］.生物學(xué)通報，2012（7）：14-16.

Application of High-Throughput Sequencing in the Analysis of Microbial Diversity of Space Mutation Daque

ZHOU Sen，HU Jiayin，ZHAO Weipeng，LIU Hongxia，YU Xiaotao and WEI Jinwang
（Niulanshan Distillery，Beijing SunxinAgriculture Co.Ltd.，Beijing 101301，China）

Space flight microbial experiment has a long history.Outer space has special environment（ultra-vacuum，ultra-clean，micro-gravity，and intense radiation）which might induce chromosome variation and further result in the change of microbial character expressions.Niulanshan No.1 Qingxiang low-temperature Daqu was once used for space flight experiment（in Shenzhou-9 spaceship and in outer space for 13 d）. In the conditions of weightless environment and intense radiation etc.，high-throughput sequencing was applied to analyze Daqu microbial diversity.Then the analytic results were compared with that of the contrast Daqu.And the results suggested that，microbial proportions in Daqu changed in outer space due to the influence of space environment.（Trans.by YUE Yang）

space mutation Daqu；contrast Daqu；high-throughput sequencing

TS261.1；Q93-3；TQ925.7

A

1001-9286（2016）09-0076-03

10.13746/j.njkj.2016122

2016-04-11

周森（1986-），男，工程師，大學(xué)本科，研究方向為白酒釀造微生物。

魏金旺。

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-06-03；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160603.1610.005.html。