張　丹，陳雪玲，付　瑜，胡先強(qiáng)，王　濤，游　玲

（1.宜賓學(xué)院，生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓644000； 2.宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川宜賓644003）

復(fù)合生物制劑在濃香型白酒黃水酯化中的應(yīng)用

張丹1，陳雪玲2，付瑜1，胡先強(qiáng)1，王濤1，游玲1

（1.宜賓學(xué)院，生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓644000； 2.宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川宜賓644003）

為探討一種自制酯化生香生物制劑在不同黃水酯化中的應(yīng)用效果，對(duì)宜賓、瀘州兩地5家企業(yè)139口濃香型白酒窖池所產(chǎn)黃水進(jìn)行窖外酯化，分別檢測(cè)酯化前后黃水中主要有機(jī)酸、酯含量變化，發(fā)現(xiàn)不同企業(yè)黃水理化指標(biāo)及酸、酯含量差異明顯且呈現(xiàn)明顯的企業(yè)特性；所有黃水酯化后丁酸乙酯及己酸乙酯含量均大幅上升，但乙酸乙酯、乳酸乙酯含量變化很小，己酸促進(jìn)黃水酯化的效果顯著，但各種酯的增加量與對(duì)應(yīng)有機(jī)酸的原有含量或消耗量之間均無(wú)明確關(guān)聯(lián)。研究結(jié)果揭示了黃水中主要有機(jī)酸酯化的部分規(guī)律，并從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度確證了酯化生香制劑用于黃水窖外發(fā)酵生香效果，為后續(xù)用于生產(chǎn)提供依據(jù)。

濃香型白酒； 黃水； 酯化； 生物制劑

黃水是濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的液態(tài)副產(chǎn)物，其中不僅含有豐富的醇、醛、酸和酯類等濃香型白酒風(fēng)味（前體）物質(zhì)，還含有豐富的淀粉、還原糖、酵母自溶物等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及大量經(jīng)長(zhǎng)期馴化的釀造微生物［1］。濃香型白酒發(fā)酵是開放式接種的多菌種固態(tài)發(fā)酵，每批次產(chǎn)品的發(fā)酵原料組分、微生物群落及工藝均存在差異，使得不同企業(yè)乃至窖池的黃水在理化指標(biāo)方面存在差異，但行業(yè)尚未對(duì)此開展較為系統(tǒng)的研究。

目前，黃水主要用于人工窖泥生產(chǎn)、養(yǎng)窖護(hù)窖以及利用其中豐富的風(fēng)味（前體）物質(zhì)提高原酒品質(zhì)或生產(chǎn)新型白酒［2］。其中，采用各種技術(shù)手段，高效利用其中豐富的風(fēng)味（前體）物質(zhì)，是行業(yè)應(yīng)用最廣的一類方式，如早期直接將黃水添加至蒸酒的底鍋水中，利用“串蒸”方式使部分風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)入酒體，后由于傳統(tǒng)串蒸效率低下，行業(yè)著重從提高黃水中風(fēng)味物質(zhì)含量及提取獲得風(fēng)味物質(zhì)技術(shù)及裝備方面開展了大量工作［3］。雖然添加己酸、乙酸等可以直接化學(xué)酯化［4-5］，但化學(xué)酯化反應(yīng)條件較為苛刻，因此實(shí)際的做法是，添加窖泥、酒尾、曲粉等發(fā)酵1～2個(gè)月［6-7］，在此基礎(chǔ)上，陳帥［8-9］、羅惠波［10］、劉賓［11］、劉子紅［12］等先后利用紅曲霉或酵母制成的各種酯化酶粗酶制劑對(duì)黃水進(jìn)行酯化，使黃水中的酯含量大幅上升，用于底鍋串蒸取得了很好的效果。

上述方案均涉及到酯化菌或酯化酶制劑的使用，但均存在各種各樣的問(wèn)題，如酯化周期過(guò)長(zhǎng)，酯化效果不穩(wěn)定，酯化后主要酯類物質(zhì)比例失調(diào)等，且由于黃水理化組成的復(fù)雜性和波動(dòng)性，現(xiàn)有研究未系統(tǒng)開展酯化影響因素及條件的研究，導(dǎo)致現(xiàn)有的市售酯化酶制劑在不同企業(yè)的應(yīng)用效果很不穩(wěn)定，影響了這一技術(shù)的推廣應(yīng)用。

在前期研究中，從宜賓濃香型白酒產(chǎn)區(qū)分離到1株高產(chǎn)酯化酶的紅曲霉菌，以及1株產(chǎn)酯生香的酵母，組成混合菌劑接種到麩皮中培養(yǎng)，得到了一種包括微生物、酶及大量風(fēng)味物質(zhì)前體在內(nèi)的黃水窖外發(fā)酵用生物制劑，初步應(yīng)用發(fā)現(xiàn)其酯化力強(qiáng)，在不改變濃香型白酒原有風(fēng)味特征的前提下，可大幅提升黃水酯含量，為探討黃水理化指標(biāo)波動(dòng)對(duì)酯化效果的影響，收集了宜賓、瀘州地區(qū)5家白酒企業(yè)的數(shù)百個(gè)黃水樣品，使用該生物制劑酯化，希望找到不同企業(yè)不同窖池黃水酯化的規(guī)律，也為該生物制劑的應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

1　材料與方法

1.1生物制劑

酯化生香生物制劑：由本實(shí)驗(yàn)室保存的1株紅曲霉菌及1株畢赤氏酵母加入麩皮混合培養(yǎng)、烘干而成。

1.2黃水

來(lái)自宜賓、瀘州濃香型白酒產(chǎn)區(qū)5家規(guī)模以上濃香型白酒生產(chǎn)企業(yè)，分別編號(hào)為H、J、T、L、X的139個(gè)黃水樣品，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。瀘州135個(gè)，宜賓312個(gè)，酯化前后黃水均12000 r/min離心10 min，0.22 μm過(guò)濾后備用。

1.3酯化方案

在250 mL三角瓶中，將200 mL黃水、2 mL己酸、10 g酯化生香生物制劑充分混勻，35℃保溫酯化5 d后，與未酯化的200 mL黃水分別添加100 mL蒸餾水，于200 mbar下，80℃蒸餾出200 mL蒸餾液，備用。

1.4檢測(cè)指標(biāo)

靜置澄清的黃水采用手持糖度計(jì)測(cè)定可溶性固形物含量，采用滴定法［13］測(cè)定酸度，采用電導(dǎo)儀測(cè)定電導(dǎo)率，采用pH計(jì)測(cè)定pH值。蒸餾液采用密度折光儀（梅特勒DM40-RX40）測(cè)定其乙醇含量。

采用氣相色譜法測(cè)定蒸餾液中4種酯及離心過(guò)濾后黃水中乙酸、丁酸、己酸含量［14］，采用C18柱（5 μm，250× 4.6 mm），通過(guò)液相色譜法檢測(cè)黃水中乳酸含量［15］：流動(dòng)相：甲醇∶0.01 mol/L（NH4）2HPO4緩沖溶液pH2.8（3∶97，v/v），柱溫28℃，流速0.7 mL/min，波長(zhǎng)215 nm。使用純度90%的L-乳酸（sigma）作為標(biāo)樣。

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行顯著性分析。

2　結(jié)果與分析

2.1不同企業(yè)黃水主要酸酯含量差異

黃水是微生物在糟醅中混菌發(fā)酵，并通過(guò)糟醅滲濾而匯聚在窖池底部的混合產(chǎn)物，其中包括了幾乎所有的白酒風(fēng)味物質(zhì)，分析黃水成分可在很大程度上揭示窖池內(nèi)微生物的代謝狀況。對(duì)來(lái)自宜賓的4家濃香型白酒企業(yè)（分別編號(hào)為H、J、T、X）及瀘州1家白酒企業(yè)（編號(hào)L）的447個(gè)黃水樣品（瀘州135個(gè)，宜賓312個(gè)）進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)兩地黃水的理化性質(zhì)及主體風(fēng)味物質(zhì)含量存在差異。

從理化指標(biāo)來(lái)看（圖1），不同企業(yè)黃水pH值差異很小，且方差很小，表明不同企業(yè)以及同一企業(yè)不同窖池的黃水pH值都很接近，這是因?yàn)榻殉貎?nèi)發(fā)酵產(chǎn)物主要是乙酸、己酸、乳酸等弱酸，具有較好緩沖能力，這也為白酒窖池內(nèi)各種生化反應(yīng)的進(jìn)行提供了一個(gè)穩(wěn)定的酸堿體系。但H企業(yè)黃水酸度明顯大于其他企業(yè)，可能是由于H企業(yè)發(fā)酵周期超過(guò)120 d，窖池內(nèi)產(chǎn)酸細(xì)菌在發(fā)酵后期的厭氧環(huán)境中產(chǎn)酸較多。

圖1　不同企業(yè)黃水主要理化指標(biāo)

黃水中可溶性固形物及乙醇含量反映了糖化、發(fā)酵的深度，從圖1可以看出，各企業(yè)黃水這兩個(gè)指標(biāo)雖有差異，但不顯著，可見窖齡、發(fā)酵時(shí)間等因素對(duì)發(fā)酵深度無(wú)顯著影響。值得注意的是，電導(dǎo)率直接反映了黃水中導(dǎo)電離子的濃度，間接反映了體系中束縛這些導(dǎo)電離子物質(zhì)的含量，即黃水中有機(jī)質(zhì)、腐殖質(zhì)等具有緩沖能力的物質(zhì)越多，游離的導(dǎo)電離子越少，T企業(yè)黃水電導(dǎo)率顯著高于H、J、X 3個(gè)企業(yè)，可能是由于T企業(yè)多數(shù)窖池生產(chǎn)歷史較短，窖池內(nèi)可用于螯合導(dǎo)電離子的緩沖物質(zhì)較少。

從圖2、圖3可以看出，由于不同生產(chǎn)工藝及生產(chǎn)歷史，各企業(yè)黃水中主要酸、酯含量有明顯差異。H、T企業(yè)黃水中總酯含量較高，主要是由于這2個(gè)企業(yè)發(fā)酵周期較長(zhǎng)，都在120 d左右；L企業(yè)黃水總酯含量低于其他4個(gè)企業(yè)，可能是由于L企業(yè)多數(shù)窖池發(fā)酵時(shí)間較短，主要通過(guò)長(zhǎng)周期發(fā)酵的“翻沙”窖池產(chǎn)酯，因此L企業(yè)窖池黃水酯含量的差異（方差）也較大；H、J、T、X企業(yè)窖池黃水中乙酸、乳酸含量較高的，其對(duì)應(yīng)的酯含量也較高，而L企業(yè)黃水中的乙酸、己酸、乳酸含量均較高，但其對(duì)應(yīng)酯含量并不高，特別是乳酸乙酯含量還顯著低于H、J、X企業(yè)，表明L企業(yè)發(fā)酵過(guò)程中，有機(jī)酸的酯化不如其他企業(yè)充分，造成這種差異的主要原因仍是L企業(yè)窖池發(fā)酵周期較短，而多數(shù)濃香型白酒企業(yè)在生產(chǎn)上也有通過(guò)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間提高酯含量；對(duì)于發(fā)酵周期超過(guò)70 d的企業(yè)來(lái)說(shuō)，H、T企業(yè)黃水中的乙酸乙酯含量高于J、X企業(yè)，與這些企業(yè)黃水中乙酸含量的差異大致吻合，且4個(gè)企業(yè)不同窖池黃水中己酸、乳酸含量高的，其己酸乙酯、乳酸乙酯含量也相對(duì)較高，表明在長(zhǎng)時(shí)間酯化的情況下，乙酸、己酸、乳酸與對(duì)應(yīng)酯的生成關(guān)聯(lián)度較大，但丁酸乙酯與丁酸含量沒(méi)有顯示出明顯對(duì)應(yīng)關(guān)系，表明發(fā)酵過(guò)程中丁酸可能不是影響丁酸乙酯生成的主要因素。

圖2　不同企業(yè)黃水中4種有機(jī)酸含量

圖3　不同企業(yè)黃水中4種酯含量差異

從各企業(yè)不同窖池黃水酯含量差異（方差）來(lái)看，生產(chǎn)歷史較短的T企業(yè)樣品間主要酯含量差異均最大，J、X企業(yè)不同窖池黃水中的丁酸乙酯含量相互間差異超過(guò)100%（方差大于平均值），而X企業(yè)不同窖池黃水中的丁酸差異很小，表明除丁酸外，還存在影響丁酸乙酯生成的重要因素。L企業(yè)不同窖池黃水中的己酸乙酯含量相互差異也超過(guò)100%，則可能是由于部分樣品來(lái)自“翻沙”窖池，而發(fā)酵周期長(zhǎng)、生產(chǎn)歷史也在20年以上的H企業(yè)窖池黃水中己酸乙酯含量低于T企業(yè)正常發(fā)酵70 d的新窖池，似乎說(shuō)明己酸乙酯的生成并不像傳統(tǒng)認(rèn)為那樣主要依賴于老窖長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵。

2.2酯化對(duì)黃水酸酯含量的影響

根據(jù)上述分析結(jié)果，在各黃水樣品中加入富含酯化酶的復(fù)合生物制劑，以及1%己酸，35℃保溫酯化120 h后檢測(cè)黃水中主要酸、酯含量，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯、乳酸乙酯含量變化不顯著，但丁酸乙酯、己酸乙酯均有大幅提升（圖4），乙酸乙酯、乳酸乙酯并未明顯增加，可能是由于在窖內(nèi)發(fā)酵過(guò)程中，乙酸、乳酸已經(jīng)達(dá)到滿足其酯化平衡的最大酯化量，在這種情況下，增加酯化酶很難使對(duì)應(yīng)酯含量增加，計(jì)算發(fā)現(xiàn)，不同窖池黃水中乙酸的酯化率在2.33%～4.64%之間，而乳酸的酯化率在42.5%～70.4%，造成不同窖池2種酸酯化率波動(dòng)的因素還包括其他有機(jī)酸濃度、溫度、酯化菌等，但一定程度上可以認(rèn)為多數(shù)窖池內(nèi)的酯化條件足以滿足黃水中乙酸、乳酸的酯化需求。

圖4　酯化對(duì)黃水中4種酯含量的影響

對(duì)己酸乙酯、丁酸乙酯而言，在外加93 mg/10 mL己酸后，大幅增加了己酸乙酯、丁酸乙酯生成，其中己酸乙酯酯化率由0.33%～1.0%變?yōu)?.19%～0.82%，略有下降，但己酸乙酯含量大幅上升，以T企業(yè)為例，扣除酯化后增加的己酸及酯化成己酸乙酯的己酸（28 mg/10 mL左右），仍有大部分己酸通過(guò)揮發(fā)損失或進(jìn)入其他代謝途徑，如分解為乙酸和丁酸，丁酸又進(jìn)一步酯化生成丁酸乙酯，導(dǎo)致丁酸乙酯上升幅度甚至超過(guò)了己酸乙酯，這也是T企業(yè)黃水中乙酸、丁酸、丁酸乙酯含量均上升的原因，但其他企業(yè)黃水酯化后丁酸乙酯含量顯著增加，而乙酸、丁酸并未明顯增加，以H企業(yè)為例，酯化前后黃水中丁酸的降低量顯然少于新增含量丁酸乙酯所需丁酸，表明丁酸另有重要來(lái)源，很可能就是來(lái)自于己酸的分解。

同時(shí)，己酸的分解也可能導(dǎo)致乙酸含量上升，如酯化后H、L、T企業(yè)黃水中乙酸含量明顯上升（圖5），但其乙酸乙酯含量反而略有降低，這可能是由于添加的酯化生香制劑及己酸改變了黃水中原有酯化平衡體系，使乙酸的酯化朝酯分解方向進(jìn)行。另一方面，H、J、L、T、X企業(yè)的丁酸乙酯含量分別提高了119.2倍、64.8倍、730.1倍、41.8倍、242.9倍，己酸乙酯含量分別提高了3.0倍、0.8倍、1.3倍、3.5倍、4.4倍，其提高幅度的差異遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了各企業(yè)丁酸、己酸的含量差異，表明外加酯化酶及己酸放大了黃水本身丁酸乙酯、己酸乙酯含量的差異，且放大的幅度與黃水中丁酸、己酸的含量沒(méi)有直接聯(lián)系，表明酯化生香制劑對(duì)黃水中酯化反應(yīng)體系的影響非常復(fù)雜，黃水窖外發(fā)酵需在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上謹(jǐn)慎開展。

圖5　酯化對(duì)黃水中乙酸、丁酸、己酸含量的影響

2.3窖齡對(duì)黃水酯化效果的影響

老窖池的黃水風(fēng)味物質(zhì)種類更豐富，酯類物質(zhì)含量也較高，為探討窖齡對(duì)酯化效果的影響，研究分析了3個(gè)企業(yè)窖齡從1年到100年的窖池黃水酯化前后的酸、酯含量變化差異（圖6—圖8）。從圖6可以看出，對(duì)T企業(yè)而言，隨著窖齡的延長(zhǎng)，7年以內(nèi)窖池黃水中的己酸乙酯、乳酸乙酯呈下降趨勢(shì)，但窖齡超過(guò)30年，二者均明顯增加，添加酯化生香制劑窖外發(fā)酵后，不同窖齡窖池黃水中各種酯的含量差異（方差）也大致維持了酯化前的水平，同時(shí)，老窖池黃水中主要有機(jī)酸、酯含量相互差異比新窖池小，酯化后仍然如此，表明酯化不能改變新老窖池黃水的差異。

圖6　T企業(yè)1年、2年、7年及32年窖池黃水中主要有機(jī)酸酯化差異

圖7　H企業(yè)10年、20年及30年窖池黃水中主要有機(jī)酸酯化差異

圖8　L企業(yè)30年及100年窖池黃水中主要有機(jī)酸酯化差異

從圖7、圖8可以看出，對(duì)H企業(yè)10年、20年、30年窖池黃水及L企業(yè)30年、100年窖池黃水來(lái)說(shuō)，隨著窖齡增加，不同窖池黃水中乳酸乙酯含量均略有增加，但酯化后乳酸乙酯、乙酸乙酯含量均有所下降，且老窖池黃水下降幅度更大，且老窖池黃水酯化后異味感也更輕，推測(cè)可能是由于在黃水中乙酸、乳酸過(guò)量的情況下，在酯化生香制劑及己酸的影響下，成分更為復(fù)雜的老窖池黃水可與酯化制劑中的風(fēng)味物質(zhì)共同作用，使少量乙酸乙酯、乳酸乙酯經(jīng)其他代謝途徑轉(zhuǎn)化，減少了單一組分帶來(lái)的缺陷味感，酯化后的黃水風(fēng)味也更自然。

3　結(jié)論與討論

黃水的酯化、串蒸一直是廣泛用于白酒生產(chǎn)的產(chǎn)酯生香方法，相關(guān)研究成果也較多。從黃水酯化方式來(lái)看，陳帥等添加紅曲酶及酵母酯化［9］，羅惠波等添加酵母和酯化酶酯化［10］，劉子紅直接添加紅曲菌酯化［12］，使總酯含量增加7倍以上［9］，己酸乙酯含量最高增加了20倍［12］，上述酯化反應(yīng)時(shí)間最短為20 d以上［9］，有的長(zhǎng)達(dá)50 d［12］，而本研究使用的自制酯化生香制劑加入黃水中酯化5 d即可取得很好的酯化效果，且僅需添加1%己酸及4%乙醇或8%酒尾，酯化后的黃水仍保持了原有風(fēng)味，同時(shí)，通過(guò)對(duì)多個(gè)企業(yè)多個(gè)窖池黃水的酯化確證了其酯化效果，并初步得到以下結(jié)論：①不同企業(yè)黃水采用酯化生香制劑酯化后，其丁酸乙酯及己酸乙酯含量大幅上升，但乙酸乙酯、乳酸乙酯含量變化不大或略有降低；②己酸促進(jìn)酯化效果顯著，但黃水中影響酯化效果的因素除酯化酶、有機(jī)酸外，尚有其他未知的重要因素，導(dǎo)致各種酯的增加量與對(duì)應(yīng)有機(jī)酸的原有含量或消耗量之間均無(wú)關(guān)聯(lián)；③酯化不能明顯改變新、老窖池黃水差異，但老窖池黃水酯化后風(fēng)味更自然。

總體上，雖然不同企業(yè)不同窖齡窖池黃水酯化效果略有差異，但這種差異更多來(lái)源于黃水本身，采用酯化生香生物制劑處理黃水前，可通過(guò)分析黃水中的酸、酯含量，據(jù)此設(shè)計(jì)較適宜的酯化方案（酯化生香生物制劑添加量、己酸添加量等），再通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證、優(yōu)化，最終用于生產(chǎn)，可使酯化生香制劑起到最好的酯化效果。

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Application of a Compound Biological Agent in the Esterification of Yellow Water of Nongxiang Baijiu

ZHANG Dan1，CHEN Xueling2，F(xiàn)U Yu1，HU Xianqiang1，WANG Tao1and YOU Ling1
（1.College of Life Science and Food Engineering，Yibin University，Yibin，Sichuan 644000；2.Yibin Vocational and Technical College，Yibin，Sichuan 644003，China）

In order to evaluate the application effects of a self-made biological agent in the esterification of different yellow water，it was used in out-pit esterification of yellow water from 139 Nongxiang Baijiu pits of 5 distilleries in Luzhou/Yibin.The change in main organic acids content and esters content in yellow water before and after the esterification were detected respectively.There was significant difference in physiochemical indexes，esters content，and acids content of yellow water from different distilleries and such difference represented evident enterprise characteristics.After the esterification，the content of ethyl butyrate and ethyl caproate in yellow water increased greatly，while the content of ethyl acetate and ethyl lactate changed little.Caproate acid promoted the esterification evidently，but there were no correlations between esters formation and acids supply or consumption.The results revealed part of the rules of the esterification of main organic acids in yellow water，statistically confirmed the effects of the biological agent in esterification and aroma-producing，and provided scientific evidence for its subsequent application.

Nongxiang Baijiu；yellow water；esterification；biological agent

TQ920.9；TS262.3；TS261.4

A

1001-9286（2016）09-0071-05

10.13746/j.njkj.2016191

固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（2015GTC001）；四川省教育廳基金項(xiàng)目（15ZB0291、11ZA225）；四川省大學(xué)生創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（201510641044）。

2016-05-31

游玲，E-mail：23686037@qq.com。

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-08-03；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160803.1013.002.html。