方佩佩，王世清，李　靜，熊旭波，譚海剛，劉曉莉

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266100）

耐酒精釀酒酵母大氣壓等離子體誘變條件的建立及選育

方佩佩，王世清，李靜，熊旭波，譚海剛，劉曉莉

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266100）

釀酒酵母在酒類發(fā)酵過程中起著非常重要的作用，但普遍存在耐酒精能力弱、發(fā)酵速度慢等問題。本研究采用大氣壓等離子體技術(shù)對釀酒酵母進(jìn)行誘變，以酵母菌株S1為出發(fā)菌株，以致死率和正突變率為指標(biāo)，對酵母菌菌齡、酵母菌濃度、輻照電壓、輻照時(shí)間、樣品與等離子電極間距和氬氣流速等影響大氣壓等離子誘變的因素進(jìn)行研究，并通過TTC顯色反應(yīng)、耐酒精性能測定、遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)、糖類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、致死溫度測定、耐高糖度測定、產(chǎn)酯能力測定等對突變酵母進(jìn)行篩選。確立了釀酒酵母大氣壓等離子體誘變的最佳條件為：酵母菌菌齡為12 h、酵母菌濃度為106個(gè)/mL、輻照電壓為165 V、輻照時(shí)間為14 min，樣品與等離子電極間距為4 cm和氬氣流速為1.0 L/h，最終篩選得到1株綜合性能較強(qiáng)的突變酵母菌株S45。

大氣壓等離子體； 誘變； 釀酒酵母； 選育

在很早以前，我國自古就開始利用酵母菌發(fā)酵釀酒，目前酵母菌仍作為主要微生物進(jìn)行乙醇發(fā)酵。作為與人類關(guān)系最為密切的微生物，酵母菌被廣泛應(yīng)用于葡萄酒、啤酒、蒸餾酒及燃料乙醇等行業(yè)［1］。不論是哪種發(fā)酵類型，降低生產(chǎn)成本、提高發(fā)酵產(chǎn)量是關(guān)鍵，高濃度發(fā)酵能夠在單位時(shí)間和體積內(nèi)提高發(fā)酵終產(chǎn)物的濃度，成為降低乙醇發(fā)酵成本的有效途徑［2］。自然界中存在的酵母菌株在發(fā)酵過程中抗外界壓力較小，發(fā)酵初期高濃度底物、高濃度乙醇產(chǎn)物等都會(huì)對酵母菌造成毒害，影響發(fā)酵產(chǎn)量［3-5］。同時(shí)，酵母菌的發(fā)酵產(chǎn)物中酯類物質(zhì)的種類和產(chǎn)量對酒的口感、香味和穩(wěn)定性有較大的影響。因此，對酵母菌株進(jìn)行誘變，選育綜合性能較強(qiáng)的酵母菌株具有重要意義。

傳統(tǒng)的誘變技術(shù)有紫外、激光輻照、化學(xué)試劑、離子注入法等［6-7］，存在遺傳穩(wěn)定性差、誘變效率低、污染環(huán)境等問題，等離子體誘變技術(shù)具有突變頻率高、誘變遺傳穩(wěn)定性好、快速、安全、無毒、無污染等特點(diǎn)，是一種新型誘變技術(shù)，能夠產(chǎn)生羥基自由基、氧原子、臭氧和過氧化氫等活性氧（ROS）［8］，這些活性氧自由基是導(dǎo)致酵母菌損傷及死亡的重要原因之一［9-10］。等離子體能引起酵母細(xì)胞的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致胞內(nèi)DNA和蛋白質(zhì)損傷、基因的改變［11］，能夠產(chǎn)生堿基缺失、染色體重復(fù)、倒位和易位等多種變異類型，誘變效率較高［8，12-13］。目前，等離子體誘變技術(shù)已經(jīng)運(yùn)用于海洋地衣芽孢桿菌、鎳吸附細(xì)菌、谷氨酸棒桿菌、肺炎克雷伯氏菌等30多種生物的誘變選育［14-20］，但等離子體技術(shù)運(yùn)用于釀酒酵母菌株，報(bào)道較少。

本研究采用大氣壓等離子體技術(shù)對釀酒酵母菌進(jìn)行誘變，初步探究了大氣壓等離子技術(shù)誘變釀酒酵母菌的最佳條件，并對突變菌株進(jìn)行篩選，得到了1株綜合性能較強(qiáng)的優(yōu)良酵母菌株。

1　材料與方法

1.1材料、試劑及儀器

1.1.1材料及試劑

釀酒酵母S1（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存酵母菌株）；色譜級甲醇、正丙醇、仲丁醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇、乙酸乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯、乳酸乙酯、戊酸乙酯等（北京京科瑞達(dá)科技有限公司）；蛋白胨、YPD培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、酵母浸粉等（青島高科園海博生物科技有限公司）；α-淀粉酶、糖化酶（青島生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2主要設(shè)備

等離子體設(shè)備（中國科學(xué)院等離子體物理研究所，圖1）；氣相色譜儀7890（上海天美儀器有限公司）；SBA-40E生物傳感分析儀（山東省農(nóng)科院生物研究所）；WFZ-2100型紫外可見分光光度計(jì)（龍尼柯儀器）；TB-214電子天平（DENVER INSTRUMENT）；XYOG02型高壓蒸汽滅菌鍋（新華醫(yī)療器械）；SW-CJ-2D無菌超潔凈工作臺(tái)（青島正恒實(shí)驗(yàn)設(shè)備）；電熱水浴鍋（龍口先科儀器公司）；手持式折光儀（北京鵬程光學(xué)儀器有限公司）。

圖1　大氣壓等離子體設(shè)備裝置圖

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1酵母菌生長曲線的測定

挑取酵母菌落到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，于200 r/min的28℃恒溫?fù)u床上培養(yǎng)，每隔2 h取1次樣，600 nm測吸光度（OD）值，以空白的YPD培養(yǎng)液為對照，根據(jù)所測得的吸光度值繪制釀酒酵母的生長曲線。

1.2.2大氣壓等離子體對酵母菌的誘變處理

挑取酵母單菌落到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10 h，梯度稀釋至106個(gè)/mL。取10 mL菌懸液于無菌平板中，保持輻照電壓165 V、處理時(shí)間14 min、電極與樣品間距4 cm、氬氣流速1.0 L/h，對其進(jìn)行誘變處理。

取0.1 mL處理后的菌懸液于YPD固體培養(yǎng)基上，涂布，并以未經(jīng)處理的菌體為對照，28℃±1℃培養(yǎng)48 h，計(jì)算經(jīng)大氣壓等離子處理后酵母菌的致死率。

從處理后的菌株中隨機(jī)挑取20～30株菌株斜面保藏，并進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，測量誘變前后菌株對酒精的耐受性，酒精耐受性變強(qiáng)的菌株即為正突變菌株，計(jì)算正突變率。

按以下公式計(jì)算致死率：

按以下公式計(jì)算正突變率：

1.2.3酵母菌對酒精耐受性的測定

配制不同酒精度9%vol、10%vol、11%vol、12%vol、13%vol、14%vol、15%vol、16%vol、17%vol、18%vol的麥芽汁培養(yǎng)基，將誘變后的菌株分別接種于不同酒精度的麥芽汁培養(yǎng)基中，采用杜氏導(dǎo)管法，恒溫培養(yǎng)0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h，觀察并計(jì)算杜氏小管內(nèi)產(chǎn)氣及失重情況，選擇產(chǎn)氣快且產(chǎn)氣量多的菌株。

1.2.4突變酵母菌株的篩選

1.2.4.1一級篩選

用大氣壓等離子體在最佳誘變條件下，對釀酒酵母菌進(jìn)行批量處理，處理得到的菌懸液涂布于PDA固體培養(yǎng)基上，29℃±1℃培養(yǎng)2 d，將10 mL TTC上層培養(yǎng)基傾倒于PDA固體培養(yǎng)基，30℃下避光培養(yǎng)2～3 h，選擇紅色較深的菌株保存。

1.2.4.2二級篩選

將初篩得到的菌株進(jìn)行耐酒精性能的測定。配制不同酒精度10%vol、12%vol、14%vol、16%vol、18%vol的麥芽汁培養(yǎng)基，將初篩得到的菌株分別接種于不同酒精度的麥芽汁培養(yǎng)基中，采用杜氏導(dǎo)管法，觀察0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h小導(dǎo)管中的產(chǎn)氣情況，選擇產(chǎn)氣快且量大的菌株。

1.2.4.3三級篩選

對正向突變的菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)、糖類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、致死溫度測定、耐高糖度測定、產(chǎn)酯能力測定等，篩選得到綜合性能較高的酵母菌株。

（1）遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：將二級篩選得到的正向突變酵母菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，測定第2代、第5代、第8代、第11代酵母菌對酒精的耐受性，篩選遺傳穩(wěn)定性較好的突變酵母菌株。

（2）糖類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：將遺傳穩(wěn)定性較好的正向突變酵母菌株進(jìn)行糖類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，將篩選得到的酵母菌分別接種在僅含有1種糖的培養(yǎng)基中，即葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、木糖、淀粉發(fā)酵培養(yǎng)基，采用杜氏試管法測定酵母菌株對不同糖的發(fā)酵利用情況。

（3）致死溫度測定：將遺傳穩(wěn)定性較好的正向突變酵母菌株進(jìn)行致死溫度測定，將篩選得到的酵母菌接種于YPD液體培養(yǎng)基中，分別在50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃條件下水浴15 min，29.0℃±1.0℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，采用杜氏試管法觀察酵母菌的致死溫度。

（4）耐高糖度測定：將篩選得到的酵母菌接種于糖度為18°Bx、20°Bx、22°Bx、24°Bx、26°Bx、28°Bx、30°Bx、32°Bx、34°Bx、36°Bx的YPD液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，采用杜氏試管法觀察酵母菌對高糖度培養(yǎng)基的耐受性。

（5）發(fā)酵產(chǎn)物的測定

酒精含量的檢測：參照GB/T 10345—2007密度瓶法。

殘?zhí)呛康臋z測：采用生物傳感分析儀進(jìn)行測定。

酯、醇、醛類物質(zhì)的測定：采用氣相色譜儀進(jìn)行測定。

氣相色譜檢測條件及方法：面積內(nèi)標(biāo)法；內(nèi)標(biāo)為乙酸正丁酯；柱溫105℃，進(jìn)樣口溫度140℃，檢測器溫度140℃；色譜柱：填充柱；色譜柱載體：Chromosorb W （AW），固定液為20%DNP（鄰苯二甲酸二壬酯）加7%吐溫80；載氣：高純氮，純度＞99.999%，柱前壓0.14 MPa。

2　結(jié)果與分析

2.1出發(fā)菌株的生長曲線

根據(jù)所測OD值作釀酒酵母的生長曲線，見圖2。

如圖2所示，6～14 h時(shí)，出發(fā)酵母菌株S1正處于對數(shù)生長期，生長繁殖旺盛。對數(shù)生長期是基因復(fù)制和重組的重要階段，在此階段對酵母菌進(jìn)行等離子體輻照，可以增加基因突變、穩(wěn)定遺傳的幾率，因此選擇菌齡6～14 h的酵母菌進(jìn)行誘變。

2.2菌懸液的制備

圖2　釀酒酵母菌生長曲線

用大氣壓等離子體對釀酒酵母進(jìn)行誘變處理，處理結(jié)果見圖3。

圖3　等離子體處理前后酵母菌平板涂布結(jié)果

如圖3所示，圖中（a）為處理前的酵母菌平板涂布，（b）為處理后的酵母菌平板涂布。對比兩張圖可以看出經(jīng)過等離子體輻照處理后，酵母菌有明顯的致死情況。

2.2.1酵母菌菌齡對等離子體誘變效果的影響

對不同菌齡的酵母菌進(jìn)行同一條件的誘變處理，結(jié)果見圖4。

圖4　酵母菌菌齡對等離子體誘變的影響

如圖4所示，致死率隨酵母菌齡的增加呈遞減趨勢，正突變率呈先增加后平穩(wěn)的趨勢。在6～12 h，酵母菌的致死率較高，可能是因?yàn)樵诖穗A段酵母菌剛剛進(jìn)入對數(shù)期，細(xì)胞結(jié)構(gòu)還不是很完整，抵抗等離子輻照的能力較弱。在12～14 h，致死率降低，可能是因?yàn)榻湍妇M(jìn)一步生長發(fā)育，細(xì)胞結(jié)構(gòu)逐漸完整，抵抗等離子體輻照的能力加強(qiáng)。在6～12 h，正突變率呈上升的趨勢，12 h后趨于平穩(wěn)，這可能由于隨著酵母菌進(jìn)入對數(shù)期其活力及自身修復(fù)機(jī)制增強(qiáng)，且在菌齡12 h后相應(yīng)細(xì)胞自身修復(fù)機(jī)制已逐漸達(dá)到最佳狀態(tài)，因此酵母菌正突變率不斷提高并趨于穩(wěn)定。綜合致死率與正突變率曲線，將酵母菌齡定為12 h。

2.2.2酵母菌濃度對等離子體誘變效果的影響

對不同濃度的酵母菌進(jìn)行同一條件的誘變處理，結(jié)果見圖5。

圖5　酵母菌濃度對等離子體誘變的影響

如圖5所示，致死率隨酵母菌濃度的增大呈遞減趨勢，正突變率呈先增加后減少的趨勢。在104～106個(gè)/mL，酵母菌在此階段基數(shù)較小，單個(gè)酵母菌受到等離子體的攻擊作用較強(qiáng)，酵母菌損傷程度較高，導(dǎo)致致死率較高；在106～108個(gè)/mL，酵母菌基數(shù)較大，單個(gè)酵母菌受到等離子體的攻擊作用較弱，致死率較低；在104～106個(gè)/mL，正突變率呈上升的趨勢，在106個(gè)/mL達(dá)到最高點(diǎn)，在106～108個(gè)/mL，正突變率呈下降趨勢。結(jié)合致死率與正突變率曲線，將酵母菌濃度定為106個(gè)/mL。

2.3釀酒酵母誘變條件的建立

2.3.1處理時(shí)間對釀酒酵母誘變效果的影響

對同一條件的釀酒酵母進(jìn)行不同時(shí)間的處理，結(jié)果見圖6。

圖6　等離子體處理時(shí)間對釀酒酵母誘變的影響

如圖6所示，隨著處理時(shí)間的增加致死率先上升后下降再上升，是馬鞍型曲線。正突變率先不變，后呈先上升后下降趨勢。等離子體輻照對酵母菌會(huì)造成損傷，當(dāng)損傷積累到一定程度時(shí)酵母菌機(jī)體能啟動(dòng)自身的修復(fù)機(jī)制，這與產(chǎn)生的馬鞍形曲線相吻合，并與吳玉峰等［12］的研究結(jié)果具有一致性。正突變率最高的點(diǎn)一般出現(xiàn)在致死率曲線的極小值處（即修復(fù)機(jī)制被激發(fā)的點(diǎn)）［12］，如圖6，正突變率在14 min達(dá)到最大值17.24%。結(jié)合致死率與正突變率曲線，初步確定最佳處理時(shí)間為14 min。

2.3.2電壓對釀酒酵母誘變效果的影響

用不同電壓處理同一條件釀酒酵母菌，結(jié)果見圖7。

圖7　等離子體輻照電壓對釀酒酵母誘變的影響

如圖7所示，隨輻照電壓的增大，致死率先上升后下降再上升，是馬鞍型曲線。正突變率先增大后減小。正突變率最高點(diǎn)和致死率曲線極小值處電壓為165 V，結(jié)合致死率與正突變率曲線，初步確定最佳輻照電壓為165 V。

2.3.3電極與樣品間距對釀酒酵母誘變效果的影響

用不同電極與樣品間距處理同一條件釀酒酵母菌，結(jié)果見圖8。

圖8　等離子電極與樣品間距對釀酒酵母誘變的影響

如圖8所示，隨著電極與樣品間距的減小，致死率先上升后下降再上升，是馬鞍型曲線。正突變率先增大后減小。正突變率最高的點(diǎn)和致死率曲線的極小值處電極與樣品間距為4.0 cm，結(jié)合致死率與正突變率曲線，初步確定最佳電極與樣品間距為4.0 cm。

2.3.4氬氣流速對釀酒酵母誘變效果的影響

用不同氬氣氣流處理同一條件釀酒酵母菌，結(jié)果見圖9。

如圖9所示，隨著氬氣流速的增大致死率先上升后下降再上升，是馬鞍型曲線。正突變率先增大后減小。正突變率最高的點(diǎn)和致死率曲線的極小值處氬氣流速為1.0 L/h。結(jié)合致死率與正突變率曲線，初步確定最佳氬氣流速為1.0 L/h。

圖9　不同等離子氬氣流速對釀酒酵母誘變的影響

2.4釀酒酵母誘變條件的正交實(shí)驗(yàn)

如表1所示，比較K值大小得出，致死率最高的組合為A3B3C1D3，即輻照時(shí)間為16 min，輻照電壓為170 V，輻照距離為3.8 cm，氬氣流速為1.2 L/h。又因?yàn)镽C＞RA＞RD＞RB，所以輻照距離對等離子誘變酵母菌的致死率影響最顯著，其次是輻照時(shí)間、氬氣流速，輻照電壓對等離子體誘變酵母菌的致死率影響最小。

如表1所示，比較K'值大小得出，根據(jù)正突變率最高的組合為A2B2C2D2，即輻照時(shí)間為14 min，輻照電壓為165 V，輻照距離為4.0 cm，氬氣流速為1.0 L/h，此條件下正突變率最高。又因?yàn)镽'A＞R'B＞R'C＞R'D，所以輻照時(shí)間對正突變率影響最顯著，其次是輻照電壓、輻照距離，氬氣流速對等離子體誘變酵母菌的正突變率影響最小。

2.5突變酵母菌的篩選

2.5.1一級篩選

圖10　TTC顯色反應(yīng)圖

根據(jù)圖10可以看出，通過等離子體誘變處理后，酵母菌發(fā)生了不同程度的變異，不同酵母菌株其代謝能力不同，顏色越深，其代謝越旺盛，從中挑選顏色較深、菌株較大的酵母菌進(jìn)行保留，經(jīng)一級篩選共篩選得到酵母菌429株。

2.5.2二級篩選

通過探究大氣壓等離子對酵母菌株誘變的最佳條件及在最佳條件下的初步篩選，共從429株菌種中篩選得到46株正向突變菌株。與出發(fā)菌株S1相比，這46株酵母菌對酒精的耐受性較高、起酵速度較快。

2.5.3三級篩選

將酵母菌進(jìn)行傳代培養(yǎng)，酵母菌對酒精的耐受性發(fā)生不同程度改變，部分酵母菌株對酒精耐受性的遺傳穩(wěn)定性較差，其中11株突變酵母菌株S45、S53、S132、S143、S182、S245、S302、S304、S353、S375、S377的遺傳穩(wěn)定性良好，對酒精的耐受性≥17%。

這11株酵母菌對糖類的利用與出發(fā)菌株一致，可以利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)生CO2，不能利用乳糖、木糖、淀粉進(jìn)行發(fā)酵，其余各項(xiàng)指標(biāo)檢測結(jié)果見表2。

其中S45、S53、S182、S377等4株酵母菌的產(chǎn)酒精能力較強(qiáng)，較出發(fā)菌株S1其產(chǎn)酒精能力分別提高了27.51%、28.91%、25.14%、26.53%，S1、S45、S53、S182的發(fā)酵產(chǎn)物色譜圖結(jié)果見圖11—圖14。

表1　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2　酵母菌株致死溫度

表3　酵母菌發(fā)酵產(chǎn)物含量表

圖11　酵母菌S1發(fā)酵產(chǎn)物色譜圖

圖12　酵母菌S45發(fā)酵產(chǎn)物色譜圖

酵母菌經(jīng)過等離子體處理后，發(fā)酵產(chǎn)物的種類和數(shù)量都發(fā)生了明顯變化，酯類、醇類、醛類等都有不同程度的改變，結(jié)果見表3。

圖13　酵母菌S53發(fā)酵產(chǎn)物色譜圖

圖14　酵母菌S182發(fā)酵產(chǎn)物色譜圖

如表3所示，突變菌株S45、S53、S182這3株菌株產(chǎn)酯能力較強(qiáng)。S45、S53、S182乙酸乙酯產(chǎn)量分別是S1的 1.95倍、2.68倍、11.15倍；菌株S45較出發(fā)菌株S1產(chǎn)生新的酯類，即乙酸異戊酯；菌株S53、S182較出發(fā)菌株S1產(chǎn)生新的酯類，即乳酸乙酯。

突變菌株S45產(chǎn)雜醇類含量較少。菌株S45的甲醇、正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇產(chǎn)量分別降低為出發(fā)菌株S1的93.75%、67.61%、86.73%、60.87%、47.63%。

突變菌株S45、S53產(chǎn)醛類含量較少。S45、S53發(fā)酵液乙醛含量分別為出發(fā)菌株S1的77.53%、73.14%。

3　結(jié)果與討論

以釀酒酵母菌對酒精的耐受性為指標(biāo)，得到釀酒酵母大氣壓等離子體誘變的最佳條件為：酵母菌菌齡為12 h、酵母菌濃度為106個(gè)/mL、輻照電壓為165 V、輻照時(shí)間為14 min、樣品與等離子電極間距為4 cm和氬氣流速為1.0 L/h。

從大氣壓等離子體誘變得到的429株酵母菌中，通過耐酒精實(shí)驗(yàn)、遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)等最終篩選得到11株酒精耐受性強(qiáng)、遺傳穩(wěn)定性好的酵母菌S45、S53、S132、S143、S182、S245、S302、S304、S353、S375、S377，對酒精的耐受性≥17%。其中，經(jīng)綜合篩選得到綜合性能優(yōu)良的耐酒精突變酵母菌株S45：對酒精的耐受性≥18%；發(fā)酵液酒精含量達(dá)18.24%，產(chǎn)酒精能力提高了27.51%；發(fā)酵液乙酸乙酯產(chǎn)量是S1的1.95倍，產(chǎn)量達(dá)到14.4 mg/L，并產(chǎn)生新的酯類，即乙酸異戊酯；產(chǎn)雜醇類含量較少，甲醇、正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇的產(chǎn)量分別降低為出發(fā)菌株S1的93.75%、67.61%、86.73%、60.87%、47.63%；產(chǎn)醛類含量較少，乙醛產(chǎn)量為出發(fā)菌株S1的77.53%。

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Establishment of the Conditions of Atmospheric Plasma-Inducing Mutation of S.cerevisiae and Breeding of an Ethanol-Tolerant Strain

FANG Peipei，WANG Shiqing，LI Jing，XIONG Xubo，TAN Haigang and LIU Xiaoli
（College of Food Science and Engineering，QingdaoAgricultural University，Qingdao，Shandong 266100，China）

S.cerevisiae plays an important role in alcoholic fermentation process，however，it has the problems such as poor alcohol tolerance and slow fermenting rate.In this study，atmospheric plasma-inducing mutation was adopted，S.cerevisiae strain S1 was used as original strain，fatality rate and positive mutation rate was used as the evaluating indexes，and the influencing factors including the age of S.cerevisiae，the concentration of S.cerevisiae suspension，irradiation voltage，irradiation time，the distance from the electrode to samples，and argon airflow speed etc.were investigated.Afterwards，the mutant strains were screened out through TTC color reaction，alcohol resistance determination，genetic stability test，sugar fermentation test，fatal temperature determination，high glucose tolerance test and esters-producing capacity test.The optimal atmospheric plasma-inducing mutation conditions were determined as follows:the age of S.cerevisiae was 12 h，the concentration of S.cerevisiae suspension was 106/mL，irradiation voltage was 165 V，irradiation time was 14 min，the distance from the electrode to samples was 4 cm，and argon airflow speed was 1.0 L/h.Finally，a mutant strain S45 with strong ethanol tolerance was obtained.

atmospheric plasma；mutagenesis；Saccharomyces cerevisiae；breeding

TS261.1；Q93-3；TS262.3

A

1001-9286（2016）09-0031-07

10.13746/j.njkj.2016163

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31271963）。

2016-05-13；

2016-06-14

方佩佩（1990-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩A藏。

王世清（1963-），男，教授，博士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩２亍?/p>

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-07-11；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160711.1059.004.html。