楊桂芹　孫佳易　郭東新*　田　河　李建濤　潘秀東

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽110866；2.沈陽愛地生物科技有限公司，沈陽110169)

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飼糧纖維源及粗纖維水平對肉兔營養(yǎng)物質(zhì)消化率、腸道消化酶活性及盲腸菌群多樣性的影響

楊桂芹1孫佳易1郭東新1*田河1李建濤1潘秀東2

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽110866；2.沈陽愛地生物科技有限公司，沈陽110169)

本試驗旨在研究飼糧纖維源及粗纖維(CF)水平對肉兔營養(yǎng)物質(zhì)消化率、腸道消化酶活性及盲腸菌群多樣性的影響。試驗采用雙因子試驗設(shè)計，依據(jù)等能等氮原則，設(shè)2種纖維源(苜蓿草粉、稻殼粉)、3個CF水平(12%、14%、16%)，共配制6種試驗飼糧。選擇144只70～80日齡、平均體重(2 002±77) g的健康伊拉生長肉兔，隨機(jī)分為6組，每組4個重復(fù)，每個重復(fù)6只兔，單籠飼養(yǎng)。飼養(yǎng)試驗為期4周，飼養(yǎng)試驗期末，采用全收糞法進(jìn)行消化試驗，之后進(jìn)行屠宰，取腸道食糜用于消化酶活性及盲腸菌群多樣性的測定。結(jié)果表明：1)苜蓿草粉組干物質(zhì)(DM)、CF、酸性洗滌纖維(ADF)、木質(zhì)素(ADL)的消化率顯著或極顯著高于稻殼粉組(P<0.05或P<0.01)，粗蛋白質(zhì)(CP)消化率則極顯著低于稻殼粉組(P<0.01)；12%CF水平組DM、中性洗滌纖維(NDF)、ADF的消化率顯著高于14%CF水平組(P<0.05)，同時該組能量的消化率及表觀消化能(ADE)極顯著高于14%、16%CF水平組(P<0.01)。2)稻殼粉組十二指腸胰蛋白酶活性極顯著高于苜蓿草粉組(P<0.01)。與14%、16%CF水平組相比，12%CF水平組的空腸淀粉酶、胰蛋白酶活性及盲腸纖維素酶活性均最低。3)纖維源對盲腸菌群豐富度和香農(nóng)指數(shù)無顯著影響(P>0.05)，但苜蓿草粉組的盲腸菌群均衡指數(shù)極顯著高于稻殼粉組(P<0.01)。CF水平對盲腸菌群豐富度和香農(nóng)指數(shù)有顯著影響(P<0.05)，其中16%CF水平組的數(shù)值均為最高。綜上所述，在本試驗條件下：1)苜蓿草粉組肉兔DM、CF、ADF、ADL的消化率及盲腸菌群均衡指數(shù)顯著或極顯著高于稻殼粉組，但十二指腸胰蛋白酶活性極顯著低于稻殼粉組。2)飼糧CF水平為12%時肉兔的ADE和各主要營養(yǎng)物質(zhì)的消化率最高；CF水平越高，肉兔空腸淀粉酶、胰蛋白酶活性和盲腸纖維素酶活性越高；飼糧CF水平為16%時肉兔盲腸菌群的多樣性較高。

肉兔；纖維源；粗纖維水平；消化率；消化酶活性；盲腸菌群多樣性

兔是單胃草食動物，發(fā)達(dá)的盲腸內(nèi)含有大量的微生物，能夠?qū)㈦y消化的纖維發(fā)酵分解成低分子有機(jī)酸等營養(yǎng)物質(zhì)，被機(jī)體吸收。因此，研究探討飼糧纖維源及粗纖維(CF)水平對肉兔消化生理和盲腸菌群的影響，對合理利用粗飼料資源、確定適宜的飼糧CF水平等具有重要實際意義。根據(jù)分析方法不同，生長兔全價配合飼料中纖維含量一般在15%～50%，其中CF水平在14%～18%[1]，范圍為12.2%～24.4%[2]。兔對飼草、飼料中纖維性物質(zhì)的消化利用能力一般在17%～25%，明顯低于牛、羊和馬等草食動物，但飼糧纖維對兔的生長和健康起著非常重要的作用。研究表明，低纖維飼糧(木質(zhì)素與纖維素的比值<0.4)會引起家兔生長率下降和食糜在消化道內(nèi)存留時間過長[3]，并且在沒有特定病原體感染的情況下，還會導(dǎo)致家兔采食和消化紊亂[4-5]，甚至腹瀉。但是如果飼糧中CF水平過高，對家兔健康也會造成損害。同時，家兔對纖維的利用又受纖維來源(品質(zhì))、飼料形態(tài)及家兔品種、日齡等多種因素的影響。一般認(rèn)為，兔對飼糧纖維的利用得益于盲腸微生物的發(fā)酵作用。因此，本試驗分別以優(yōu)質(zhì)(苜蓿草粉)和低質(zhì)(稻殼粉)2種粗飼料為主要纖維源，并分別設(shè)3個CF水平，配制6種試驗飼糧，研究不同纖維源及CF水平對肉兔營養(yǎng)物質(zhì)消化率、腸道消化酶活性的影響，同時從定性水平上探討肉兔腸道菌群多樣性與纖維源及CF水平的關(guān)系，為深入研究飼糧纖維對肉兔的營養(yǎng)生理作用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗動物和飼糧

選擇144只70～80日齡健康伊拉(Hyla)配套系商品代生長肉兔，初始平均體重(2 002±77) g，

依據(jù)性別和體重隨機(jī)分為6組，分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ組，每組4個重復(fù)，每個重復(fù)6只兔，在同一兔舍內(nèi)單籠飼養(yǎng)，飼喂不同飼糧。試驗飼糧采用雙因子析因試驗設(shè)計，在等能等氮條件下，設(shè)2種纖維源(苜蓿草粉、稻殼粉)、3個CF水平(12%、14%、16%)。苜蓿草粉和稻殼粉在配方中的比例分別為24.50%、31.50%、37.50%和14.00%、17.50%、22.00%。參照文獻(xiàn)[6]中的家兔常用飼料原料化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)，配制6種試驗飼糧，其組成及營養(yǎng)水平見表1，所有飼糧制成直徑約4 mm的顆粒。

1.2試驗過程及樣品采集

飼養(yǎng)試驗為期4周，飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，每個重復(fù)取1只兔(確保每組雌雄各2只)，采用全收糞法進(jìn)行消化試驗。之后進(jìn)行屠宰，迅速取出空腸、十二指腸、盲腸食糜(2份)于10 mL的帶蓋離心管中，立即放入液氮罐速凍20 min，取出至-80 ℃冰箱保存待測。

表1　試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項目Items苜蓿草粉飼糧AlfalfahaymealdietsⅠⅡⅢ稻殼粉飼糧RicehuskmealdietsⅣⅤⅥ粗蛋白質(zhì)CP17.0716.7416.9317.0516.5217.33粗纖維CF12.2013.7815.8012.4914.2115.84中性洗滌纖維NDF20.3919.7220.1325.4124.4027.55酸性洗滌纖維ADF14.4914.2616.5419.5617.6822.64酸性洗滌木質(zhì)素ADL2.164.332.804.166.215.67纖維素Cellulose12.339.9313.7415.4011.4716.97半纖維素Hemicellulose5.905.463.595.856.724.91鈣Ca0.820.700.820.850.780.89總磷TP0.750.670.770.820.710.75

1)礦物質(zhì)預(yù)混料為每千克飼糧提供Mineral premix provides the following per kg of diets:Zn 50.0 mg，Mn 80.0 mg，F(xiàn)e 25.0 mg，Cu 8.0 mg，I 2.0 mg，Se 0.1 mg，Mg 133.4 mg。

2)維生素預(yù)混料為每千克飼糧提供Vitamin premix provides the following per kg of diets:VA 12 020 IU，VD32 100 IU，VE 12 IU，VK 2.0 mg，VB11.1 mg，VB23.0 mg，VB61.5 mg，VB120.005 mg，泛酸 pantothenic acid 9 mg，煙酸 nicotinic acid 10.0 mg，生物素 biotin 0.15 mg，葉酸 folic acid 0.44 mg，膽堿 choline 350 mg。

3)消化能為計算值，其余均為實測值。DE is a calculated value and the others are measured values.

1.3測定指標(biāo)和方法

1.3.1營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率

消化試驗預(yù)試期1周，正試期4 d，記錄和稱量每只兔每天的實際采食量及收集全部新鮮糞便并稱重。采集部分糞便樣品，一份用10%鹽酸溶液固定揮發(fā)性氮后用于測定粗蛋白質(zhì)(CP)含量，另一份不固氮用于測定其他養(yǎng)分指標(biāo)。糞便樣品置65～70 ℃烘箱烘至恒重，取出在空氣中回潮24 h后稱重，測定初水分含量。將風(fēng)干樣品用研磨機(jī)粉碎并過40目篩(篩孔徑為0.45 mm)，以重復(fù)為單位，將4 d的糞樣混勻，取部分樣品裝入樣品袋中密封保存?zhèn)錅y。其中，干物質(zhì)(DM)含量依據(jù)GB/T 6435—2006測定；CP含量采用KjelFlex K-360型自動凱氏定氮儀(Büchi，瑞士)測定；CF、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)、酸性洗滌木質(zhì)素(ADL)含量采用ANKOM A2000i全自動纖維分析儀(Ankom，美國)測定；總能使用IKA C2000全自動量熱儀(IKA，德國)測定。

1.3.2腸道消化酶活性

應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法測定空腸和十二指腸食糜的淀粉酶、胰蛋白酶活性及盲腸食糜的纖維素酶活性。試劑盒購自南京建成生物工程研究所，按照操作說明進(jìn)行。

1.3.3盲腸菌群多樣性

1.3.3.1基因組DNA的提取

采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)手提法[7]提取樣品基因組DNA。

1.3.3.2細(xì)菌16S rDNA片段的PCR擴(kuò)增

以樣品基因組DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物GC-338F(5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGGCGGGGCGGGGGCGCGGGGGGCCT ACG GGA GGC AGC AG-3′)和518R(5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′)擴(kuò)增樣品16S rDNA的V3區(qū)序列。PCR擴(kuò)增體系(50 μL)為:10×PCR Buffer 5 μL、dNTP(2.5 mmol/L)3.2 μL、rTaq(5 U/μL)0.4 μL、GC-338F(20 μmol/L)1 μL、518R(20 μmol/L)1 μL、模板DNA 50 ng，補(bǔ)ddH2O至50 μL。PCR擴(kuò)增程序為:94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；最終72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物采用Omega公司的DNA Gel Extraction Kit純化回收。PCR儀為Biometra公司生產(chǎn)的T-gradient，凝膠成像儀為Bio-Rad公司的Gel-Doc2000凝膠成像系統(tǒng)。

1.3.3.3PCR產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析

取10 μL PCR的產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析。采用變性梯度為35%～55%、濃度為7%的聚丙烯酰胺凝膠在1×TAE緩沖液中150 V 60 ℃條件下電泳5 h。DGGE完畢后，采用銀染法染色。

PCR-DGGE圖譜采用Bio-Rad公司的Quantity one分析軟件包對每個樣品的電泳條帶數(shù)目、條帶密度進(jìn)行數(shù)字化分析。

(1)戴斯系數(shù)(Cs)為不同樣品間菌群差異的兩兩比較，計算公式如下：

Cs=2j/(Nx+Ny)

式中：Cs為戴斯系數(shù)；Nx為x泳道條帶數(shù)；Ny為y泳道條帶數(shù)；j為2個泳道共有的條帶數(shù)。

用MEGA 4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行聚類分析。

(2)香農(nóng)指數(shù)、豐富度和均衡指數(shù)的計算公式如下：

E=H/Hmax=H/lnS。

式中：H為香農(nóng)指數(shù)；pi為樣品中單一條帶的強(qiáng)度在該樣品所有條帶總強(qiáng)度中所占的比率；N為DGGE圖譜單一泳道上所有條帶的密度；Ni為第i條帶的密度；S為豐富度，即某樣品中所有條帶數(shù)目總和；E為均衡指數(shù)；Hmax是H的最大值(最大均勻性條件下的多樣性值)。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

以重復(fù)為單位進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計，采用IBM SPSS Statistics version 22統(tǒng)計軟件的GLM過程進(jìn)行方差分析，纖維源和CF水平為固定因子。采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較檢驗，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1飼糧營養(yǎng)物質(zhì)消化率

由表2可知，消化試驗期內(nèi)以稻殼粉為纖維源的肉兔NDF、ADF、ADL的進(jìn)食量極顯著高于以苜蓿草粉為纖維源的肉兔(P<0.01)。16%CF水平組肉兔CF、NDF、ADF的進(jìn)食量極顯著高于12%和14%CF水平組(P<0.01)，纖維源及CF水平的交互作用極顯著地影響肉兔各營養(yǎng)物質(zhì)的進(jìn)食量(P<0.01)。纖維源對飼糧中DM、CP、CF、ADF、ADL的消化率有顯著影響(P<0.05)，以苜蓿草粉為纖維源時除CP的消化率極顯著低于苜蓿草粉組(P<0.01)外，其他各營養(yǎng)物質(zhì)的消化率均顯著高于稻殼粉組(P<0.05)。CF水平對DM、NDF、ADF的消化率有顯著影響(P<0.05)，12%CF水平組DM的消化率顯著高于14%CF水平組(P<0.05)，NDF、ADF的消化率則呈現(xiàn)出“兩端(12%、16%CF)高，中間(14%CF)低”的變化趨勢。

14%CF水平的稻殼粉組(Ⅴ組)DM的消化率顯著低于除Ⅵ組外的其余各組(P<0.05)。16%CF水平的苜蓿草粉組CF的消化率顯著高于12%、14%CF水平的稻殼粉組(P<0.05)。16%CF水平的稻殼粉組NDF的消化率顯著高于14%CF水平的苜蓿草粉組(P<0.05)。以苜蓿草粉為纖維源的3個組的ADF和ADL的消化率均高于以稻殼粉為纖維源的3個組。

纖維源對飼糧表觀消化能(ADE)無顯著影響(P>0.05)，CF水平、纖維源與CF水平的交互作用對ADE有極顯著影響(P<0.01)。12% CF水平組的ADE極顯著高于14%和16%CF水平組(P<0.01)，以12%CF水平的苜蓿草粉組的ADE最高(12.99 MJ/kg)。纖維源、纖維源與CF水平的交互作用對能量消化率無顯著影響(P>0.05)，但CF水平對能量消化率具有極顯著的影響(P<0.01)。

2.2腸道消化酶活性

由表3可知，纖維源對十二指腸胰蛋白酶活性有極顯著的影響(P<0.01)。CF水平對空腸胰蛋白酶活性有顯著影響(P<0.05)，對盲腸纖維素酶活性有極顯著的影響(P<0.01)。而纖維源和CF水平的交互作用對十二指腸淀粉酶活性有極顯著的影響(P<0.01)，對盲腸纖維素酶活性有顯著影響(P<0.05)。以稻殼粉為纖維源的肉兔十二指腸胰蛋白酶活性極顯著高于以苜蓿草粉為纖維源的肉兔(P<0.01)。

12%CF水平組的空腸淀粉酶(1 053.96 U/g)、胰蛋白酶活性(35.54 U/mg)及盲腸纖維素酶活性(213.87 μg/g)均最低。16%CF水平的稻殼粉組空腸胰蛋白酶活性顯著高于12%CF水平的苜蓿草粉和稻殼粉組(P<0.05)，12%CF水平的稻殼粉組的十二指腸淀粉酶活性(1628.16 U/g)極顯著高于16%CF水平的稻殼粉組(P<0.01)，顯著高于12%和14%CF水平的苜蓿草粉組(P<0.05)。12%和14%CF水平的苜蓿草粉組的十二指腸胰蛋白酶活性顯著低于其余各組(P<0.05)。12%CF水平的苜蓿草粉組的盲腸纖維素酶活性極顯著低于其余各組(P<0.01)。

表3　飼糧纖維源及CF水平對肉兔腸道消化酶活性的影響

組別Groups纖維源FibersourceCF水平CFlevel/%空腸淀粉酶Jejunalamylase/(U/g)空腸胰蛋白酶Jejunaltrypsase/(U/mg)十二指腸淀粉酶Duodenalamylase/(U/g)十二指腸胰蛋白酶Duodenaltrypsase/(U/mg)盲腸纖維素酶Cecalcellulose/(μg/g)ⅠⅡⅢ苜蓿草粉Alfalfahaymeal121234.6436.42a1022.47ABab49.43ABa134.94Aa141661.2848.37ab1130.45ABab44.65Aa364.20Bb161120.2556.10ab1481.20ABbc135.90Bb343.79BbⅣⅤⅥ稻殼粉Ricehuskmeal12873.2934.66a1628.16Bc134.18Bb292.81Bb141072.4757.25ab1198.86ABabc136.49Bb346.32Bb161706.8065.47b827.43Aa139.53Bb338.52Bb主效應(yīng)Maineffects纖維源Fibersource苜蓿草粉Alfalfahaymeal1338.7246.971211.3776.66X280.98稻殼粉Ricehuskmeal1217.5252.461218.15136.74Y325.88CF水平CFlevel/%121053.9635.54a1325.3291.81213.87Aa141366.8852.81ab1164.6690.57355.26Bb161413.5360.79b1154.31137.72341.16BbP值P-value纖維源Fibersource0.6080.4130.9550.0030.138CF水平CFlevel0.4100.0230.4430.0510.001纖維源×CF水平Fibersource×CFlevel0.1290.7360.0030.0770.041

2.3盲腸菌群結(jié)構(gòu)

2.3.1菌群相似性分析

圖1、圖2分別為24個盲腸菌群樣本基因組DNA提取結(jié)果和16S rDNA PCR產(chǎn)物的DGGE分析結(jié)果。由圖2可知，兔盲腸總菌樣品包含的微生物種類較多，圖譜條帶也較多。條帶最多的是來自16%CF水平的稻殼粉組的樣本6-1，有52條。條帶最少的是來自14%CF水平的稻殼粉組的樣品5-1、5-2、5-4，均為34條。依據(jù)各泳道的條帶數(shù)目及所在位置，計算Cs，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。由圖3可知，6個組的24個盲腸樣本明顯地聚為兩大類，由上至下樣本4-2至5-2聚為一類、2-4至3-3聚為一類。但每大類都有來自不同組的樣本。相似性較高(Cs>0.5)的有4簇，分別是樣本1-2與6-1、樣本6-2與5-2、樣本5-4與6-3、樣本4-3與3-3。總體看，組間及重復(fù)間無明顯的聚類規(guī)律，如樣本4-1、4-2、4-3、4-4為同一組的不同試驗兔的盲腸內(nèi)菌群樣本，卻很難同時聚到同一個分支上。

2.3.2菌群多樣性分析

由表4可知，纖維源對盲腸菌群豐富度(即DGGE條帶數(shù))和香農(nóng)指數(shù)無顯著影響(P>0.05)，但以苜蓿草粉為纖維源的肉兔盲腸菌群均衡指數(shù)極顯著高于以稻殼粉為纖維源的肉兔(P<0.01)。CF水平對盲腸菌群豐富度和香農(nóng)指數(shù)有顯著影響(P<0.05)，其中16%CF水平組的數(shù)值均為最高。纖維源及CF水平的交互作用對盲腸菌群多樣性無顯著影響(P>0.05)。

3　討　論

3.1飼糧纖維源及CF水平對肉兔營養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響

兔對纖維的消化主要取決于盲腸微生物活性、食糜在盲腸的停留時間及纖維的化學(xué)組成及結(jié)構(gòu)[1]。李清宏等[8]表明，獺兔對以苜蓿草粉為主要纖維源的配合飼料的CF及CP的消化率(分別為28.77%、82.94%)顯著高于以玉米秸和大豆秸稈為主要纖維源的配合飼料，但3種纖維源對獺兔粗脂肪(EE)、NDF和ADF的消化率無顯著影響。本研究表明，除CP以外，苜蓿草粉組飼糧各主要營養(yǎng)物質(zhì)的消化率均顯著高于稻殼粉組，而稻殼粉組飼糧CP的消化率則極顯著高于苜蓿草粉組，與以上報道不完全一致，推測可能與稻殼粉組肉兔空腸和十二指腸胰蛋白酶的活性高于或顯著高于苜蓿草粉組有關(guān)。CF水平對DM、NDF、ADF的消化率有顯著影響，低CF水平(12%)組肉兔DM、能量的消化率及ADE顯著高于中、高CF水平(14%、16%)組，但NDF、ADF的消化率則呈現(xiàn)出“兩端(12%、16%CF)高，中間(14% CF)低”的變化趨勢。這與何仁春等[9]報道的12%CF水平對2月齡肉兔飼糧CF及能量的消化率顯著高于10%、14%CF水平，即“兩端低中間高”的結(jié)果不一致。此結(jié)果與兔的日齡和纖維源的化學(xué)組成有關(guān)，本試驗中14% CF水平飼糧中的ADL含量高于12%和16%CF飼糧(表1)，較高的ADL含量影響了食糜的通過率及纖維的發(fā)酵[1]?？梢?，不同纖維源由于其纖維的具體組成成分不同，即使CF水平相同，其消化率也有差別；同時也說明肉兔對飼糧養(yǎng)分，尤其是纖維的消化率并未隨飼糧CF水平的提高呈線性變化。因此，對肉兔纖維營養(yǎng)的研究仍然有待深入，以確定組成纖維素和半纖維素基本單位對于其消化率的影響。本研究表明，提高飼糧中CF水平會降低能量的消化率，與喬建國等[10]的結(jié)果一致，主要是由于CF水平升高會加重消化道的負(fù)擔(dān)，還可在盲腸內(nèi)形成較多的乙酸及較少的丙酸和丁酸，丁酸抑制腸蠕動的作用降低，使得腸道興奮性增強(qiáng)，蠕動加快，導(dǎo)致飼糧在盲腸內(nèi)的停留時間短，營養(yǎng)物質(zhì)消化率低[11]。另外，飼糧中的可溶性纖維具有增加食糜黏度、減少食糜與消化酶的接觸、阻礙養(yǎng)分吸收等作用。因此，在配制飼糧時，應(yīng)根據(jù)家兔品種、生理階段、纖維品質(zhì)等來調(diào)整CF水平。

圖1　24個盲腸菌群樣本的基因組DNA提取結(jié)果

3.2飼糧纖維源及CF水平對肉兔腸道消化酶活性的影響

兔腸道營養(yǎng)物質(zhì)的消化主要依賴體內(nèi)消化酶的作用。兔消化系統(tǒng)的酶譜與其他單胃動物相似，其自身能分泌淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等，但不能分泌纖維素酶。飼料中的纖維素只能靠腸道微生物產(chǎn)生的纖維素酶消化利用，纖維性物質(zhì)在盲腸經(jīng)細(xì)菌發(fā)酵，被分解為揮發(fā)性脂肪酸經(jīng)腸壁吸收作為能量來源。

腸道內(nèi)容物中胰蛋白酶活性被認(rèn)為是反映機(jī)體蛋白質(zhì)消化能力的一個較好的指標(biāo)。崔文典[12]研究表明，幼兔腸道內(nèi)容物中淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性隨飼糧CF水平(10%、12%、14%)的提高而降低。晁洪雨等[13]報道，隨著ADF水平的增加，3月齡肉兔腸道胰蛋白酶與胰凝乳蛋白酶活性有先增加后降低的趨勢。此外，肉兔盲腸纖維素酶活性隨飼糧CF水平的提高而提高[12-13]。本研究表明，16%CF水平顯著提高了肉兔空腸胰蛋白酶的活性，極顯著提高了盲腸纖維素酶活性。而12%CF水平組肉兔空腸淀粉酶、胰蛋白酶活性及盲腸纖維素酶活性顯著低于14%、16%CF水平組?？梢?，有關(guān)CF水平對盲腸纖維素酶活性的影響所有報道都一致，主要是因為纖維到達(dá)盲腸和結(jié)腸中，在腸道微生物作用下被分解成揮發(fā)性脂肪酸(VFA)，VFA為纖維素分解菌提供了能量，從而增加了盲腸內(nèi)纖維素分解菌的數(shù)量和活性。因此，在配合肉兔飼糧時，可考慮適當(dāng)提高飼糧的CF水平或選擇使用更高纖維含量的飼料原料，以降低飼養(yǎng)成本。楊桂芹等[14]的關(guān)于纖維源及CF水平對肉兔生長性能的影響的研究結(jié)果也證實了這一點。而有關(guān)CF水平對腸道淀粉酶及蛋白酶活性的影響相關(guān)報道不完全一致，主要與各研究中所使用的纖維源和CF水平變異較大，其中的可溶性和不溶性纖維的比例存在差異有關(guān)。本研究表明，與苜蓿草粉相比，以稻殼粉為纖維源極顯著提高了肉兔十二指腸胰蛋白酶活性，這可能與稻殼粉組飼糧中的不溶性纖維含量高，促進(jìn)了消化液的分泌有關(guān)，也可能是兔腸道消化酶對飼料中的纖維表現(xiàn)出了“適應(yīng)性的分泌”，這有待于進(jìn)一步研究和證實。

樣本1-1、1-2、1-3，1-4來自Ⅰ組，樣本2-1、2-2、2-3、2-4來自Ⅱ組，樣本3-1、3-2、3-3、3-4來自Ⅲ組，樣本4-1、4-2、4-3、4-4來自Ⅳ組，樣本5-1、5-2、5-3、5-4來自Ⅴ組，樣本6-1、6-2、6-3、6-4來自Ⅵ組。下圖同。

Samples 1-1, 1-2, 1-3 and 1-4 come from group Ⅰ, samples 2-1, 2-2, 2-3 and 2-4 come from group Ⅱ, samples 3-1, 3-2, 3-3 and 3-4 come from group Ⅲ, samples 4-1, 4-2, 4-3, 4-4 come from group Ⅳ, samples 5-1, 5-2, 5-3 and 5-4 come from group Ⅴ, and samples 6-1, 6-2, 6-3 and 6-4 come from group Ⅵ. The same as below.

圖216S rDNA PCR產(chǎn)物的DGGE圖譜

Fig.2DGGE fingerprints of 16S rDNA PCR products

圖3　依據(jù)戴斯系數(shù)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹聚類分析

組別Groups纖維源FibersourceCF水平CFlevel/%豐富度(條帶數(shù)量)Speciesrichness(bandquantity)香農(nóng)指數(shù)Shannon-wienerindex均衡指數(shù)SpeciesevennessⅠⅡⅢ苜蓿草粉Alfalfahaymeal1237.75ab3.58ab0.988c1439.50ab3.62ab0.985bc1644.00b3.72b0.985bcⅣⅤⅥ稻殼粉Ricehuskmeal1239.00ab3.60ab0.980abc1435.25a3.47a0.978ab1642.25ab3.64b0.975a纖維源Fibersource苜蓿草粉Alfalfahaymeal40.423.640.986Y稻殼粉Ricehuskmeal38.833.570.976XCF水平CFlevel/%1238.38x3.59xy0.9841437.38x3.54x0.9811643.13y3.68y0.980P值P-value纖維源Fibersource0.3790.0990.003CF水平CFlevel0.0350.0370.461纖維源×CF水平Fibersource×CFlevel0.4570.2830.892

3.3飼糧纖維源及CF水平對肉兔盲腸菌群多樣性的影響

盲腸作為飼糧纖維消化的主要場所，是利用微生物產(chǎn)生的酶或微生物的代謝產(chǎn)物來分解CF。在正常狀況下，有益菌占絕對優(yōu)勢，細(xì)菌間形成一種相當(dāng)穩(wěn)定的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)。盲腸細(xì)菌的種類、數(shù)量及其平衡性是肉兔消化機(jī)能健康與否的重要標(biāo)志，也是消化道結(jié)構(gòu)和機(jī)能正常與否的重要體現(xiàn)。

PCR-DGGE技術(shù)是一種快速可靠的比較菌群多樣性以及群落變化的方法，其中依據(jù)Cs構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹能夠直觀形象地反映不同樣本間菌群的相似程度，也可反映該樣品中微生物群落組成相對于其他樣品的特異性。本研究中各樣本間盲腸菌群相似性很低，無明顯的聚類規(guī)律，說明不同組間及重復(fù)間肉兔盲腸微生物群落結(jié)構(gòu)組成差異較大。這與朱巖麗[15]測定的生長肉兔個體間腸道菌群結(jié)構(gòu)有較大的差異的結(jié)果一致。因此，在今后有關(guān)兔的腸道菌群研究上需適當(dāng)增大樣品數(shù)量，以增強(qiáng)其代表性。Michelland等[16]研究表明，降低飼糧ADF水平(20.4% vs. 10.7%)會改變生長肉兔盲腸微生物組成和細(xì)菌種屬的相對豐度，但不改變其多樣性。本研究表明，高CF水平(16%)顯著提高了肉兔盲腸菌群豐富度和多樣性，與以上報道不完全一致，這與纖維源的組成有關(guān)；但與劉蓓一[17]報道的隨著纖維水平的提高，鵝盲腸微生物的種類也增加的結(jié)果一致。

Awati等[18]研究表明，飼糧種類不同，兔腸道微生物區(qū)系組成不同，其中飼糧纖維起著重要的作用。De Filippo等[19]報道，吃富含纖維類食物的非洲兒童的糞便菌群中擬桿菌門(Bacteroidetes)比例高，厚壁菌門(Firmicutes)比例低，而攝入高蛋白質(zhì)低纖維食物的歐洲兒童的糞便菌群中則缺乏Bacteroidetes。Matsui等[20]認(rèn)為，含有Bacteroidetes豐富的盲腸，其發(fā)酵作用更強(qiáng)。谷子林等[21]研究表明，飼糧CF水平(7%、9%、12%、14%)對斷乳仔兔盲腸微生物數(shù)量有較大影響，以12%CF水平組有益菌的數(shù)量占有絕對優(yōu)勢；過高和過低的CF水平，尤其是過低CF水平會導(dǎo)致有益菌數(shù)量大幅度降低，有害菌(大腸桿菌、沙門氏菌)數(shù)量增高?？梢姡趯嶋H生產(chǎn)中可逐步提高飼糧中的CF水平，通過微生物區(qū)系對底物的適應(yīng)能力來提高兔對纖維類飼料的利用率。

4　結(jié)　論

① 苜蓿草粉組肉兔DM、CF、ADF、ADL的消化率顯著或極顯著高于稻殼粉組；12% CF水平組肉兔DM、NDF、ADF的消化率顯著高于14%CF水平組，而能量的消化率及ADE極顯著高于14%、16%CF水平組。

② 稻殼粉組肉兔十二指腸胰蛋白酶活性極顯著高于苜蓿草粉組；CF水平越高，肉兔空腸淀粉酶、胰蛋白酶活性和盲腸纖維素酶活性越高。

③ 纖維源對肉兔盲腸菌群均衡指數(shù)有顯著影響；16%CF水平顯著提高了肉兔盲腸菌群的豐富度和多樣性。

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*Corresponding author, associate professor, E-mail: guodx@sina.com

(責(zé)任編輯菅景穎)

Effects of Dietary Fiber Source and Crude Fiber Level on Nutrient Digestibility, Intestinal Digestive Enzyme Activities and Cecal Microbial Diversity of Meat Rabbits

YANG Guiqin1SUN Jiayi1GUO Dongxin1*TIAN He1LI Jiantao1PAN Xiudong2

(1. College of Animal Husbandry and Veterinary, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China;2. Shenyang Aidi Biotechnology Co., Ltd., Shenyang 110169, China)

This experiment was conducted to determine the effects of dietary fiber source and crude fiber (CF) level on nutrient digestibility, intestinal digestive enzyme activities and cecal microbial diversity of meat rabbits. Six diets were formulated according to a two-factor experiment design based on isonitrogenous and isocaloric, one factor was fiber source (alfalfa hay meal and rice husk meal), and another was CF level (12%, 14% and 16%). A total of 144 Hyla growing rabbits with the age of 70 to 80 days and average body weight of (2 002±77) g were selected and randomly allocated in individual cages for six groups of 4 replicates containing six rabbits per replicate. The feeding trial lasted for 4 weeks. Digestion experiment was conducted by the method of total fecal collection at the end of feeding trial. Afterwards, rabbits were slaughtered, and intestinal contents were sampled and stored for digestive enzyme activities and cecal microbial diversity determination. The results showed as follows: 1) meat rabbits fed diets with the alfalfa hay meal as fiber source had significantly higher dry matter (DM), CF, acid detergent fiber (ADF) and acid detergent lignin (ADL) digestibility compared with meat rabbits fed diets with the rice husk meal as fiber source (P<0.05 orP<0.01), while the crude protein (CP) digestibility in alfalfa hay meal group was significantly lower than that in rice husk meal group (P<0.01). The digestibility of DM, neutral detergent fiber (NDF) and ADF of meat rabbits in 12% CF level group was significantly higher than that in 14% CF level group (P<0.05). Moreover, the apparent digestive energy (ADE) and energy digestibility in 12% CF level group were significantly higher than those in 14% and 16% CF level groups (P<0.01). 2) Meat rabbits fed diets with rice husk meal as fiber source had significantly higher duodenal trypsase activity compared with meat rabbits fed diets with alfalfa hay meal as fiber source (P<0.01). Meat rabbits fed diets with 12% CF level had the lowest jejunal amylase activity, jejunal trypsase activity and cecal cellulose activity. 3) There was no significant difference between the 2 fiber sources in cecal flora species richness and Shannon-wiener index were detected (P>0.05), but meat rabbits fed diets with alfalfa hay meal as fiber source had the significantly higher cecal flora species evenness than that of meat rabbits fed diets with rice husk meal as fiber source (P<0.01). CF level had significant effects on species richness and Shannon-wiener index of cecal flora (P<0.05), and meat rabbits fed 16% CF level diet had the highest values. In this experimental condition, the results demonstrate as follows: 1) the digestibility of DM, CF, ADF and ADL and cecal flora species evenness of meat rabbits in alfalfa hay meal group are significantly higher than those in rice husk meal group, but the duodenal trypsase activity is significantly lower than that in rice husk meal group. 2) Meat rabbits fed diets with 12% CF have the highest ADE and main nutrient digestibility, and the higher CF level the higher jejunal amylase activity, jejunal trypsase activity and cecal cellulose activity. Meat rabbits fed diets with 16% CF have the higher cecal microbial diversity.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(9)：2861-2871]

meat rabbits; fiber source; CF level; digestibility; digestive enzyme activities; cecal microbial diversity

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.09.025

2016-03-09

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項——兔(CARS-44-B-2)

楊桂芹(1966—)，女，遼寧凌源人，教授，博士，從事動物營養(yǎng)與飼料研究。E-mail: guiqiny@126.com

郭東新，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail: guodx@sina.com

S829.1

A

1006-267X(2016)09-2861-11