林碧蓮

（福建省產品質量檢驗研究院， 福建 福州 350002）

不同金黃色葡萄球菌選擇性分離平板效果比較及探討

林碧蓮

（福建省產品質量檢驗研究院， 福建 福州 350002）

針對GB 4789.10-2010中Baird-Parker平板對金黃色葡萄球菌特異性低，選擇性弱等問題，文章引入金黃色葡萄球菌顯色平板進行補充和改進，結果顯示顯色平板上金黃色葡萄球菌菌落形態(tài)典型，顏色特異，具有良好的特異性和較強的抗干擾能力。定量比對結果顯示Baird-Parker平板與顯色平板上金黃色葡萄球菌數值無顯著性差異，將顯色平板應用于金黃色葡萄球菌的定量檢測具有良好的適用性和較高的可行性。

金黃色葡萄球菌；Baird-Parker平板；金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基

金黃色葡萄球菌是人類常見的食源性致病菌之一，產毒菌株可引起食物中毒，歷年來在我國各個省市食源性致病菌監(jiān)測中金黃色葡萄球菌的檢出率排名居高不下[1-3]?，F有的檢測方法很多，但只有傳統(tǒng)的培養(yǎng)法被廣泛認可，其檢測過程依據標準GB4789.10-2010[4]進行，其中以Baird-Parker平板作為定量分離培養(yǎng)基，但其存有很多缺陷，蔡芷荷等[5]發(fā)現其它葡萄球菌如緩慢葡萄球菌，賽氏葡萄球菌在Baird-Parker平板的菌落特征跟金黃色葡萄球菌很相似，同樣為黑色菌落，有渾濁帶和明顯的透明圈；趙薇等在進行金黃色葡萄球定量檢測能力驗證時，采用顯色平板計數的結果為Baird-Parker平板的兩倍，更接近目標值[6]，說明Baird-Parker平板在雜菌多的情況下可能存在特異性差，靈敏度低等問題，這些嚴重影響了金黃色葡萄球菌的分離率，給日常檢測判讀帶來很大的難度。

因此亟需引進性能更好的培養(yǎng)基以更有針對性的高效定量分離金黃色葡萄球菌。目前，金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基因其具有較高的特異性和靈敏度而得到相關檢驗技術者的青睞，其通過抑制一些雜菌，并能使目標菌形成特定的顏色或形態(tài)而被有效鎖定。國內學者對其進行了深入的研究，主要比較分析Baird-Parker平板和各種顯色平板的特異性，各平板對金黃色葡萄球菌的靈敏度，以及實際樣品檢測數據差異的顯著性等[6-9]，但對于摻雜菌的定量比對的報道較少，也未見有對金黃色葡萄球菌顯色平板進行相關的質量驗收程序的報道，因此文章率先應CNAS-CL09：2013質量要求[10]，開展商業(yè)化顯色平板的質控驗收，并測試3種培養(yǎng)基對混雜菌中金黃色葡萄球的靈敏度，比對測試結果以確定顯色培養(yǎng)基作為金黃色葡萄球菌的定量計數平板的適用性和可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

表1 混合菌液在3種平板的菌落總數及目標菌的檢出情況

實驗用菌株均來自于美國模式培養(yǎng)物集存庫，編號分別為金黃色葡萄球菌：ATCC25923、表面葡萄球菌：ATCC1222、大腸埃希氏菌：ATCC25922、單核細胞增生李斯特氏菌：ATCC19115、糞腸球菌：ATCC29212；所用的平板計數瓊脂（PCA）、營養(yǎng)瓊脂（NA）、血平板、金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；Baird-Parker瓊脂、腦心浸出液培養(yǎng)液購于北京陸橋技術股份有限公司；法國科瑪嘉金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基購于鄭州博賽生物技術股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的質量驗收

參照GB 4789.28-2013[11]的商品化培養(yǎng)基質量控制中Baird-Parker平板的驗收方法以及廣東環(huán)凱顯色培養(yǎng)基產品說明書中質控說明，將金黃色葡萄球菌、表面葡萄球菌、大腸埃希氏菌、糞腸球菌、單核細胞增生李斯特氏菌的新鮮培養(yǎng)液分別接種于Baird-Parker平板和環(huán)凱、科瑪嘉兩種顯色培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)后觀察菌落形態(tài)、特異性并計算目標菌株（金黃色葡萄球菌）和陰性菌株（大腸埃希氏菌）的G值。

1.2.2 培養(yǎng)基的靈敏度檢測

將上述5株菌的新鮮培養(yǎng)物分別用生理鹽水制成菌懸液，并通過預實驗（PCA平板菌落計數）確定菌濃度并適當稀釋至約1000 CFU.mL-1，后各取1 mL菌液混合，補充生理鹽水至10 mL，按照GB 4789.10-2010[4]第二法進行顯色平板Baird-Parker平板的涂布及后續(xù)的確證實驗，所得的菌落數值用于后期的比較分析。

2 結果

2.1 菌落形態(tài)特征

金黃色葡萄球菌在廣東環(huán)凱顯色培養(yǎng)基上的菌落為紫紅色，菌落直徑大于科瑪嘉顯色培養(yǎng)基的菌落，科瑪嘉顯色培養(yǎng)基上的菌落為粉色至淡紫色，Baird-Parker平板上菌落黑色，圓潤，周圍有渾濁帶和明顯的透明圈。

表面葡萄球菌在環(huán)凱、科瑪嘉兩種顯色平板微弱生長，呈半透明、乳白色的小菌落，在Baird-Parker平板上菌落呈黑色，有渾濁帶及細小的透明圈。單核細胞增生李斯特氏菌在兩種顯色平板均為藍綠色菌落，生長良好，在Baird-Parker平板上生長良好，菌落黑色，無渾濁帶和透明圈。糞腸球菌在顯色平板上為藍綠色菌落，生長微弱，在Baird-Parker平板上生長良好，菌落為黑色，無渾濁帶和透明圈。

2.2 培養(yǎng)基的質量驗收及特異性驗證結果

金黃色葡萄球菌在環(huán)凱、科瑪嘉顯色平板和Baird-Parker平板3種培養(yǎng)基上均生長良好，G值分別為10.5、9、11.5；大腸埃希氏菌在3種培養(yǎng)基上都不生長，G值都等于0，都達到GB 4789.28-2013商品化分離平板目標菌的質控要求（目標菌株G值＞6，陰性菌株＜1）。

2.3 培養(yǎng)基靈敏度的測試結果

表1顯示了混合菌液在環(huán)凱、科瑪嘉顯色平板和Baird-Parker平板3種平板的菌落數及目標菌數，其中Baird-Parker平板上的菌落總數明顯大于顯色平板，類似的，疑似目標菌數Baird-Parker平板也明顯高于顯色平板。但是，經過確證實驗，3種平板的目標菌數的平均值分別為87，89，90(單位都為CFU.mL-1)，無顯著性差異。

3 分析與討論

Baird-Parker平板含有的氯化鋰和亞碲酸鉀能抑制大多數非葡萄球菌類雜菌的生長。金黃色葡萄球菌代謝產生的卵磷脂酶和脂肪酶，能分解卵黃使得菌落周圍形成渾濁沉淀環(huán)和透明圈，同時由于亞碲酸鉀被還原而使菌落呈黑色。此次試驗中單核細胞增生李斯特氏菌、糞腸球菌、表皮葡萄球菌在Baird-Parker平板都為黑色菌落，表皮葡萄球菌有渾濁帶和透明圈、與目標菌顏色形態(tài)相似具有干擾作用；顯色平板中特定的顯色底物能使目標菌菌落顯現特定的顏色，而干擾菌被抑制或不產生特征性顏色，使目標菌直觀易于挑取和計數，金黃色葡萄球菌顯色平板上金黃色葡萄球菌菌落呈粉紅色或紫紅色，表面葡萄球菌呈細小的乳白色菌落，單核細胞增生李斯特氏菌和糞腸球菌為藍綠色菌落，各種菌的菌落特征明顯，特異性強，易于金黃色葡萄球菌的有效鎖定。

從混合菌液中篩選金黃色葡萄球菌，兩種顯色平板的菌落總數(約380 CFU/mL)明顯低于Baird-Parke平板（486 CFU/mL），說明顯色平板對雜菌的抑制效果更好，抗雜菌干擾性的能力更強?？梢删鋽档谋容^（Baird-Parker平板平均值113 CFU/mL，顯色平板平均值分別為87 CFU/mL,89 CFU/mL）也說明這一問題；最后3種培養(yǎng)基確認的目標菌數據平行性好，檢測結果無顯著差異，說明顯色培養(yǎng)具有較高的適用性。國內外相關學者的報道也證實這一點，報道中指出在實際樣品檢驗中，顯色平板檢測性能優(yōu)于Baird-Parker平板[5-9，12]。此外，研究結果顯示2種顯色平板都符合GB 4789.28-2013的商品化培養(yǎng)基驗收要求。所以，將金黃色葡萄球菌顯色平板應用于金黃色葡萄球菌的定量檢測具有良好的可行性，在國家標準未修改前，建議引進此顯色培養(yǎng)基作為GB 4789.10-2010中金黃色葡萄球菌檢測的輔助手段。

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O651

A

1007-550X（2016）07-0040-03

10.3969/j.issn.1007-550X.2006.07.001

2016-06-20

林碧蓮（1985-），女，福建漳州人，主要從事微生物檢驗工作。