許　敬　郭新海　葛明華

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬舟山醫(yī)院乳腺疾病診治中心，浙江舟山316000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬舟山醫(yī)院甲狀腺外科，浙江舟山316000；3.浙江省腫瘤醫(yī)院頭頸外科，浙江杭州310022

甲狀腺乳頭狀癌中TSHR與NIS基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與侵襲性相關(guān)性研究

許敬1郭新海2葛明華3

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬舟山醫(yī)院乳腺疾病診治中心，浙江舟山316000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬舟山醫(yī)院甲狀腺外科，浙江舟山316000；3.浙江省腫瘤醫(yī)院頭頸外科，浙江杭州310022

目的本研究分析甲狀腺乳頭狀癌中促甲狀腺素受體與鈉碘轉(zhuǎn)運體基因啟動子區(qū)甲基化狀況，探討甲狀腺功能基因甲基化與甲狀腺乳頭狀癌病理侵襲性之間相關(guān)性。方法采用甲基化熒光實時特異聚合酶鏈反應(yīng)甲狀腺乳頭狀癌中TSHR與NIS基因啟動區(qū)異常甲基化情況，探討該區(qū)甲基化與病理參數(shù)之間的關(guān)系，以及兩基因甲基化之間相關(guān)情況。結(jié)果甲狀腺癌中NIS與TSHR基因甲基化均高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。TSHR啟動區(qū)域5’-CpG島甲基化分別與病灶多少、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及局部侵犯有關(guān)（P＜0.05），NIS基因啟動子區(qū)域5’-CpG島甲基化分別與患者年齡、多病灶、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理分期有關(guān)（P＜0.05），兩基因甲基化相關(guān)性分析：①TSHR啟動子甲基化發(fā)生顯著高于NIS；②TSHR與NIS基因的啟動子區(qū)甲基化有關(guān)系。結(jié)論乳頭狀甲狀腺癌的功能基因TSHR與NIS基因啟動區(qū)甲基化是常見現(xiàn)象，可能在甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，可能與腫瘤侵襲性相關(guān)。兩組基因甲基化具一定相關(guān)性，聯(lián)合兩個基因啟動子區(qū)域甲基化檢測可能更有意義。

甲狀腺乳頭狀癌（PTC）；鈉/碘協(xié)同轉(zhuǎn)運體（NIS）；促甲狀腺素受體（TSHR）；甲基化；實時熒光定量甲基化-PCR

［Abstract］Objective To investigate the methylation status of the promoter region of NIS and TSHR gene promoter region in papillary thyroid carcinomas（PTC），and relation between Methylation of TSHR and NIS gene promoter region correlated and aggressiveness.Methods The promoter region of TSHR and NIS 5'-CpG island methylation of tumor tissue and corresponding adjacent thyroid tissues were detected by real time methylation-specific PCR（qMSP）.The relationship between methylation status and clinical pathological parameters were analyzed.In addition，the correlation between methylation of two genes was studied.Results The rate of methylation of TSHR and NIS were higher than adjacent tissues（P＜0.01）.Significant correlation existed among TSHR gene promoter 5'-CpG island methylation with le sions numbers，local invasion，lymph node metastasis respectively（P＜0.05），but not with clinical stage，gender and age.Similarly，Significant correlation existed among NIS methylation with patient age，lesions numbers，lymph node metastasis and clinical stage，respectively（P＜0.05），but not with tumor size，local invasion andgender.Relationship between NIS methylation and TSHR methylation in Papillary Thyroid Carcinomas：（1）The methylation rates of TSHR gene was significantly higher than that of NIS in PTC（P＜0.01）；（2）The relationship of methylation status of the promoter region of TSHR and NIS in PTC was positive correlation（P＜0.01）.Conclusion Methylations of TSHR and NIS gene in promoter region are common molecular events，which make significant role in the development of PTC，may enhance tumor aggressiveness.

［Key words］Papillary thyroid carcinomas（PTC）；Thyroid stimulating hormone receptor（TSHR）；Na+/I-symporter，（NIS）；Methylation；Real time methylation-specific PCR（qMSP）

近年來甲狀腺癌顯著增高，已成為發(fā)病率增長速度最快的實體惡性腫瘤之一［1］。天津市腫瘤醫(yī)院頭頸腫瘤科的調(diào)查資料顯示，天津等沿海地區(qū)是甲狀腺癌的高發(fā)地區(qū)，發(fā)病率明顯高于內(nèi)陸地區(qū)，且有繼續(xù)上升趨勢，近20年來由0.8/10萬上升至2.5/10萬。浙江省甲狀腺癌報告平均發(fā)病率為8.37/10萬，死亡率隨年齡增加而上升，2007～2011年甲狀腺癌發(fā)病率每年以接近30%的速度快速上升，已經(jīng)成為發(fā)病率上升最快的腫瘤之一［2］。美國國立癌癥研究院2010年發(fā)布數(shù)據(jù)表明全美的甲狀腺癌年發(fā)病數(shù)已經(jīng)超過40 000例，累積患病數(shù)超過400 000例［3］。

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinomas，PTC）是甲狀腺惡性腫瘤中最常見類型［4］，目前對其發(fā)病原因尚有較大爭議，認為與輻射以及遺傳學(xué)改變和外環(huán)境變化等多種因素相關(guān)，現(xiàn)已經(jīng)公認促甲狀腺激素受體（thyroid stimulating hormone receptor，TSHR）與鈉碘轉(zhuǎn)運體（Na+/I-symporter，NIS）在甲狀腺癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用［5-7］。

促甲狀腺素受體（TSHR）是甲狀腺特異蛋白，位于細胞膜表面。TSH通過與TSHR結(jié)合發(fā)揮作用，通過激活細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑上調(diào)鈉/碘協(xié)同轉(zhuǎn)運體的表達，發(fā)揮對碘代謝功能的調(diào)節(jié)作用。TSH-TSHR信號系統(tǒng)相關(guān)蛋白在甲狀腺癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用［8，9］。NIS位于甲狀腺細胞濾泡上皮基底膜上，主要負責(zé)將血中的碘轉(zhuǎn)運到甲狀腺細胞內(nèi)，是維持甲狀腺胞內(nèi)高碘濃度的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

若上述兩種功能蛋白功能異常，將干擾甲狀腺濾泡上皮細胞對于碘元素的細胞外攝取、細胞內(nèi)濃聚和利用［5］。近年來，有研究表明甲狀腺乳頭狀癌中存在著NIS基因表達降低或“沉默”，可能是PTC癌變及導(dǎo)致臨床放射性碘治療失敗的直接原因［6］。

我們計劃收集128例甲狀腺乳頭狀癌組織及對應(yīng)癌旁正常組織，采用甲基化特異性聚合鏈反應(yīng)（qM SP）檢測中NIS和TSHR啟動子區(qū)甲基化情況，并探討甲基化與病理侵襲性的相關(guān)性。

1　材料與方法

1.1材料來源

全部研究病例來自浙江省舟山醫(yī)院甲狀腺癌根治術(shù)的甲狀腺乳頭狀癌病例128例，年齡16～75歲，平均42.6歲，其中男21例，女107例。收集甲狀腺腫瘤石蠟切片與臨床病理學(xué)分期等資料，單個病灶70例，多發(fā)病灶58例；T1（腫瘤大小≤2 cm）82例，T1以上（腫瘤直徑＞2 cm）46例；腫瘤局限腺內(nèi)型68例，腺外侵犯（侵犯包膜）60例；同時伴有頸部淋巴結(jié)（含氣管前淋巴結(jié)）轉(zhuǎn)移61例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移67例；Ⅰ/Ⅱ期合計83例，Ⅲ/Ⅳ期45例。腫瘤分期參照美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）標(biāo)準(zhǔn)［10］。標(biāo)本均經(jīng)病理組織學(xué)HE切片證實為甲狀腺乳頭狀癌，并經(jīng)兩位病理醫(yī)生審核確證。選取原發(fā)性乳頭狀甲狀腺癌病例入組，排除其他類型甲狀腺惡性腫瘤及轉(zhuǎn)移性癌。

1.2DNA提取

在光學(xué)顯微鏡下取得目標(biāo)腫瘤細胞以及腫瘤邊緣旁開3 mm組織（癌旁組織），獲取約4000個目標(biāo)細胞后，蛋白酶消化，將提取純化的微量DNA放入Ependorf管，恒溫孵育3 d后終止反應(yīng)，收集基因組DNA。

1.3甲基化測定

采用實時熒光定量甲基化特異性PCR（qMSP）法檢測TSHR與NIS啟動子區(qū)5'-CpG甲基化狀態(tài)，亞硫酸氫鈉法修飾DNA并純化回收，按照TSHR與NIS基因序列分別設(shè)計TSHR與NIS基因5'-CpG特異甲基化和非甲基化引物成。甲基化判定方法由計算甲基化百分率決定，甲基化百分率（M%）=100×（目標(biāo)基因甲基化DNA拷貝數(shù)/甲基化加非甲基化拷貝數(shù)之和）。M%＞25.0判定為甲基化。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對NIS及TSHR啟動區(qū)基因的異常甲基化在甲狀腺乳頭狀癌組織中表達情況，并且從多角度對于上述甲狀腺乳頭狀癌病理侵襲性相關(guān)參數(shù)與基因啟動子區(qū)異常甲基化之間的相關(guān)性進行學(xué)分析。兩組間數(shù)據(jù)采用χ2檢驗或Fisher’s確切概率法進行分析，相關(guān)性分析時使用Spearman秩相關(guān)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兩種基因啟動子區(qū)域5’-CpG島甲基化狀況

在128例PTC腫瘤組織標(biāo)本中，TSHR基因與NIS基因異常甲基化的發(fā)生率分別為53.13%（68/128）和34.38%（44/128），癌旁組織中，分別有10例（7.81%）與9例（7.03%）檢出甲基化基因。與癌旁對照組織相比，甲狀腺乳頭狀癌組織中，兩種基因的甲基化差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2PTC腫瘤組織中TSHR與NIS基因啟動子區(qū)5’-CpG島甲基化與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性分析

2.2.1TSHR甲基化與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性分析①TSHR甲基化在不同年齡、性別以及腫塊大小之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；②多病灶、侵犯腺體外、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者TSHR甲基化陽性率高，組間差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；③Ⅲ/Ⅳ期的TSHR基因甲基化陽性率高于Ⅰ/Ⅱ期組，但兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2.2NIS甲基化與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性分析

①NIS甲基化在不同年齡之間差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義；②與性別、腫塊大小、局部侵犯包膜與否差異無統(tǒng)計學(xué)意義；③多病灶、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者NIS甲基化陽性率高，組間差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；Ⅲ/Ⅳ期的TSHR基因甲基化陽性率高于Ⅰ/Ⅱ期組，較早與較晚期兩組間差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

2.3甲狀腺乳頭狀癌中TSHR基因與NIS基因啟動子區(qū)5’-CpG島甲基化的相關(guān)性分析

腫瘤組織中TSHR與NIS基因甲基化率比較及二者關(guān)聯(lián)性：128例腫瘤標(biāo)本中，腫瘤組織中TSHR與NIS基因甲基化的總發(fā)生率為60.15%（77/128），與癌旁正常組織比較有顯著差異（P＜0.01）；TSHR基因甲基化的發(fā)生率為53.13%，TSHR啟動子甲基化發(fā)生率高于NIS的啟動子甲基化（P＜0.01）；TSHR與NIS啟動子區(qū)甲基化之間正相關(guān)（r=0.356，P＜0.01），見表2。

表1　腫瘤組織與正常組織間TSHR與NIS基因啟動子區(qū)異常甲基化程度比較［n（%）］

表2　甲狀腺乳頭狀癌組織中TSHR與NIS基因甲基化一致性分析

3　討論

近年來，隨著表觀遺傳學(xué)研究進展，基因甲基化在細胞分子生物學(xué)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用越來越受到各個領(lǐng)域的重視［11］。學(xué)界普遍認為腫瘤抑制基因失活，原因有突變、等位基因丟失，抑癌基因與功能基因啟動子區(qū)異常甲基化也是常見而重要的原因，可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄“沉默”，甚至可能抑癌基因失活的唯一機制［12，13］，導(dǎo)致細胞功能缺失或“突變”形式惡性生長［14］，已經(jīng)成為腫瘤病因?qū)W的研究熱點。

促甲狀腺激素受體（TSHR）是甲狀腺細胞的主要功能受體，分布于甲狀腺濾泡上皮細胞膜上［15，16］。受TSH激活的TSHR對NIS基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)具有雙重意義以維持穩(wěn)定，進而影響甲狀腺癌的血管新生、增殖等分化過程［17］。鈉碘轉(zhuǎn)運體是一種位于甲狀腺濾泡細胞膜的糖蛋白，介導(dǎo)將活化的碘離子轉(zhuǎn)送至胞內(nèi)，這是甲狀腺激素生物合成關(guān)鍵的基礎(chǔ)步驟［18］。人類的NIS（hNIS）基因定位于19p13.2-p12［19］。位于轉(zhuǎn)錄起始點前的NIS上游增強子區(qū)（NUE）NIS基因的調(diào)控區(qū)域是NIS轉(zhuǎn)錄所必需的［20］。

Venkataraman等［21］在1999年提出在分化型甲狀腺癌中存在NIS區(qū)啟動子區(qū)的異常甲基化。采用MSP方法檢測了23例甲狀腺癌樣本的NIS啟動子甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)NIS的表達情況與甲狀腺癌的臨床分期存在關(guān)聯(lián)，中晚期病例中的NIS陽性表達量相對較低。他們還試驗使用去甲基化藥物——地西他濱（5-雜氮-2-脫氧胞苷）處理hNIS mRNA的7個人類甲狀腺細胞系，發(fā)現(xiàn)其中4個細胞系的hNIS mRNA恢復(fù)表達，且有2個細胞系中碘化物轉(zhuǎn)運恢復(fù)。地西他濱在甲狀腺癌細胞系中誘導(dǎo)NIS mRNA表達和恢復(fù)碘攝取的能力進一步證實啟動子區(qū)甲基化是NIS表達缺失的可能機制。這與部分侵襲性強的甲狀腺癌對內(nèi)分泌治療耐藥以及碘攝取率低情況相符，警示甲狀腺癌的侵襲性可能與基因啟動子區(qū)異常甲基化相關(guān)。本試驗結(jié)果還提示大于45歲的老年人組中基因發(fā)生甲基化相對較多，其中NIS組的差異更為明顯，提示甲基化與年齡存在一定相關(guān)性。

長久以來，甲狀腺癌的手術(shù)范圍一直是外科爭論的領(lǐng)域，部分高侵襲性甲狀腺癌常見局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和多原發(fā)病灶，而不加選擇的對于所有甲狀腺癌病例全選擇全甲狀腺切除未免陷入“過度治療”的誤區(qū)。如何選擇合適的“腫瘤標(biāo)記物”鑒別甲狀腺腫瘤的侵襲性程度，指導(dǎo)甲狀腺癌的診治一直都是本研究所涉及的兩個甲狀腺功能基因甲基化均與腫瘤侵襲性病理表現(xiàn)相關(guān)，但敏感性與特異性尚待提高。我們設(shè)想甲狀腺術(shù)前細針穿刺時，在明確甲狀腺乳頭狀癌的診斷前提下，另取少量組織提取DNA分析腫瘤侵襲性相關(guān)分子水平標(biāo)記物，可資臨床手術(shù)方式選擇參考。結(jié)合目前甲狀腺手術(shù)前常規(guī)行細針穿刺活檢的前提，我們考慮將來可能在術(shù)前穿刺標(biāo)本細胞學(xué)檢測基礎(chǔ)上進行甲狀腺癌高危因素分子標(biāo)記物檢測，為術(shù)中是否行全甲狀腺切除以及行頸部淋巴結(jié)清掃提供參考依據(jù)，當(dāng)然這還需要尋找更多和更有效的檢測候選位點。國內(nèi)也有學(xué)者［22］報道TSHR、NIS基因甲基化與多種腫瘤高侵襲性相關(guān)，但因為研究組例數(shù)不多，未取得顯著性差異。

本試驗選取128例舟山海島地區(qū)居民中甲狀腺乳頭狀癌的標(biāo)本中，檢測TSHR與NIS兩種功能基因啟動子區(qū)甲基化程度，發(fā)現(xiàn)PTC組織中上述兩種基因的啟動子區(qū)甲基化均顯著高于癌旁組織。另外，將TSHR與NIS甲基化情況與多個病理參數(shù)比較后，發(fā)現(xiàn)功能基因甲基化與多病灶、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等多個高危侵襲因素相關(guān)，提示聯(lián)合多位點基因甲基化檢測具有甲狀腺癌全切除分子標(biāo)記物的潛在可能。

分析TSHR基因與NIS甲基化相關(guān)性后顯示甲狀腺乳頭狀癌組織中TSHR啟動子甲基化發(fā)生顯著高于NIS的啟動子甲基化（P＜0.01）；分析兩者間關(guān)聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)TSHR與NIS基因的啟動子甲基化呈正相關(guān)（P＜0.01）。本研究近期發(fā)現(xiàn)hMLH1基因甲基化同樣是甲狀腺乳頭狀癌的多發(fā)分子事件，且與TSHR及NIS之間相關(guān)性弱；提示甲狀腺的功能基因與抑癌基因均存在啟動子區(qū)異常甲基化，提示甲狀腺癌中多種基因的甲基化與否與某種共同因素有關(guān)，不同位點基因的甲基化間存在相關(guān)關(guān)聯(lián)影響的網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)證據(jù)尚不充足［23］。基于甲狀腺乳頭狀癌中存在多位點基因甲基化表現(xiàn)，加之部分基因甲基化與BRAF突變關(guān)系已經(jīng)得到證實，我們推測BRAF基因突變，導(dǎo)致絲裂原活化蛋白激酶等分子通路持續(xù)性激活，進一步導(dǎo)致了多個基因位點的甲基化，但還需要進一步深入研究來驗證［24-26］。

結(jié)合上述研究結(jié)果，甲狀腺乳頭狀癌中常見TSHR與NIS基因啟動子區(qū)異常甲基化，在甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用［27，28］。甲狀腺功能基因TSHR、NIS啟動區(qū)甲基化是甲狀腺癌的多發(fā)現(xiàn)象，可能是導(dǎo)致甲狀腺癌內(nèi)分泌治療耐藥與甲狀腺細胞攝碘率下降的原因，提示異常甲基化在甲狀腺癌發(fā)病機制中的重要作用，為其個性化診治提供了客觀的實驗依據(jù)。甲狀腺乳頭狀癌中TSHR、NIS甲基化高發(fā)與侵襲的相關(guān)性可資作為分子腫瘤標(biāo)記物指導(dǎo)甲狀腺癌早期診斷和手術(shù)方式。

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The relation between methylation of TSHR and NIS gene promoter region correlated and aggressiveness in papillary thyroid carcinoma

XU Jing1GUO Xinhai2GE Minghua3
1.Comprehensive Breast Health Center，the Affiliated Zhoushan Hospital of Wenzhou Medical University，Zhoushan 316000，China；2.Department of Thyroid Surgery，the Affiliated Zhoushan Hospital of Wenzhou Medical University，Zhoushan316000，China；3.Department of Head and Neck Surgery，Zhejiang Cancer Hospital，Hangzhou310022，China

R736.1

A

1673-9701（2016）21-0001-05

2016-05-31）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生重大科技計劃項目（WKJ2012-2-021）；浙江省舟山市醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃（2012A01）