朱海振　鄭召鵬　江飛龍　韓靜　李雪濤　陳光朋　李杭　陳正堂

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·論著·

基于分子信標技術對活細胞內miR-155檢測用于肺癌診斷

朱海振1鄭召鵬1江飛龍2韓靜3李雪濤3陳光朋3李杭1陳正堂3

目的探討激光共聚焦檢測miR-155 MB對肺癌活細胞中miR-155的識別成像功能。 方法設計鎖核酸修飾的miR-155分子信標(MB)，同時設計不和任何序列結合的隨機序列分子信標(RS MB)作為陰性對照；采用液相分子雜交試驗驗證其靈敏性和特異性，并進一步在肺腫瘤組織水平上驗證。以納米殼聚糖(CS)作為載體轉染miR-155 MB，檢測miR-155 MB對肺癌細胞中miR-155識別成像功能；同時采用miR-155抑制劑antagomir抑制miR-155的表達后檢測miR-155 MB對肺癌細胞中miR-155的識別成像功能。 結果液相分子雜交實驗中miR-155+miR-155 MB組熒光強度為miR-155 MB組的58倍，RS+RS MB組熒光強度為RS MB組的43倍(P<0.05)。在肺鱗癌、腺癌組織中，激光共聚焦可檢測到較強的熒光信號，陰性對照組未檢測到明顯熒光信號。納米殼聚糖轉染miR-155 MB后, 可在肺癌活細胞中檢測到較強的熒光信號，antagomir抑制miR-155的表達后，發(fā)現(xiàn)熒光信號明顯降低(P<0.05)。 結論利用分子信標技術可以實現(xiàn)通過識別肺癌活細胞中的miR-155并成像肺癌細胞，從而為發(fā)現(xiàn)肺癌細胞并用于肺癌診斷提供了新的理論基礎。

肺腫瘤；分子信標；microRNA

肺癌目前仍是我國發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，不少患者確診時屬于晚期，失去了手術機會，生存期短，病死率高[1-2]。分子信標(molecular beacon, MB)是一種發(fā)卡結構的熒光標記的寡核苷酸序列，由于分子信標本身不會產生熒光，當存在靶標DNA、RNA和微小RNA(miRNA)時，分子信標就會與之雜交產生熒光，所以可以根據(jù)檢測熒光信號及熒光強度實現(xiàn)對靶DNA、RNA和miRNA進行實時成像和定量分析[3]。miRNAs是一類非編碼的含有約20～22個核苷酸小RNA分子，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、凋亡、侵襲轉移中發(fā)揮重要作用[4]。miR-155是miRNA中常見的一種小分子RNA，在肺癌細胞及組織中高表達，在肺癌的發(fā)生、發(fā)展及預后中發(fā)揮重要作用[5]。因此，本研究基于以上理論，利用分子信標技術設計并合成miR-155 MB，檢測其對肺癌活細胞中miR-155的識別成像功能，旨在為發(fā)現(xiàn)肺癌細胞提供新的理論基礎。

材料與方法

一、主要材料

1. 細胞株：A549肺腺癌細胞系、H446小細胞肺癌細胞系購自美國典型菌種保藏中心(ATCC)，人肺腺癌SPC-A1細胞購自中國科學院上海生化研究所。

2. 試劑和儀器：鎖核酸修飾的miR-155 MB、RS MB由上海生工合成。Opti-MEM?I轉染培養(yǎng)基、Tris 堿(三羥甲基氨基甲烷) 購自美國life technology公司。氯化鉀、氯化鎂購自成都科龍化學試劑廠。PRMI-1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，殼聚糖納米由四川廣漢恒宇新材料有限公司惠贈。SP5激光共聚焦掃描顯微鏡(德國LEICA公司)，Varioskan Flash多功能酶標儀(美國賽默飛世爾科技有限公司 )

二、實驗方法

1. 分子信標的設計與合成: 從網站http://www.mirbase.org上檢索成熟的人miR-155(hsa-miR-155)序列，根據(jù)hsa-miR-155設計合成miR-155 MB。同時設計陰性對照RS(random sequence) MB，即合成不與任何基因組序列結合的隨機序列分子信標。MiR-155 MB ：5′-Cy5-C+CAGCG-ACC+CCT+ATCA+CGAT+TAGCATTAA-CGCT+GG-BHQ3-3′；RS MB: 5′-Cy5-C+CAGCG-AC+GCCA+ATG+ACC+TTA+AGCA TTAA-CGCT+GG-BHQ3-3′。3′端連接淬滅基團BHQ3，5′端連接紅色熒光基團Cy5；劃線部分為莖狀結構序列，其余為環(huán)狀機構序列；+N表示鎖核酸(LNA)堿基修飾。合成的分子信標用TE(pH=8.0)稀釋為10 μmol/L的儲存液并分裝后避光-20 ℃凍存。

2. 液相分子雜交實驗 : 配置100 ml的雜交緩沖液，其中含10 mmol/L KCl、10 mmol/L Tris緩沖液和5 mmol/L MgCl2。取6 μl濃度為10 μmol/L的miR-155 MB或RS MB加入到594 μl的雜交緩沖液中，分子信標終濃度為100 nmol/L，總體積為600 μl，分裝到96孔黑板的5個孔內，每孔體積100 μl。同時加入100 μl濃度為1 000 nmol/L的miR-155 MB和RS MB的靶向序列，濃度增高的目的是為保證分子信標與靶分子能夠充分的結合。以緩沖液為空白孔，以未加靶分子序列的分子信標作為對照組，同時設置加入相同濃度比例的miR-155 MB+RS組和RS MB+miR-155組，驗證分子信標的特異性，37 ℃恒溫水浴箱內孵育60 min，Varioskan Flash多功能酶標儀檢測各組Cy5的熒光強度。

3. miR-155分子信標檢測人肺癌組織中miR-155的表達: 參考文獻[6]方法 ，收集新橋醫(yī)院經術后病理證實的新鮮肺鱗癌和腺癌標本各3例，常規(guī)制備冰凍切片，冰丙酮固定10 min，每張切片滴加100 nmol/L的miR-155分子信標50 μl，37 ℃孵育60 min；PBS充分漂洗后DAPI染細胞核，抗熒光淬滅封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡檢測miR-155 MB對肺癌組織中miR-155的識別成像功能，以RS MB作為陰性對照。

4. 細胞培養(yǎng) : PRMI-1640培養(yǎng)基中加入10%的標準胎牛血清、青霉素鏈霉素雙抗，A549、SPC-A1、H446肺癌細胞系均置于5% CO2、37 ℃孵箱中培養(yǎng)。

5. 激光共聚焦檢測CS轉染miR-155 MB后及antagomir抑制后對肺癌細胞中miR-155的識別成像功能: 取生長狀態(tài)良好的A549、SPC-A1、H446肺癌細胞種板于激光共聚焦專用培養(yǎng)皿內，其中一組按試劑說明書操作加入終濃度為10 nmol/L的miR-155抑制劑antagomir作用24 h。參考本課題組前期研究方法[7]，按照Wcs/WMB質量比為7︰1的比例自組裝方法合成CS-mir-155 MB及CS-RS MB，miR-155 MB和RS MB的終濃度為200 nM，37 ℃細胞培養(yǎng)箱內孵育120 min后加入300 μl Hoechst 33342染細胞核，37 ℃ 20 min，激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照，每組設置三個樣本。

6. 熒光強度分析: 激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照后，每個培養(yǎng)皿內加入1 ml細胞裂解液，使細胞充分裂解。取96孔黑板，每組加入100 μl細胞裂解液，設置6個復孔，Varioskan Flash多功能酶標儀檢測各組Cy5的熒光強度。

三、統(tǒng)計學方法

結　　果

一、液相分子雜交實驗

當只有miR-155 MB和RS MB單獨存在時，熒光信號很弱。當加入相對應的miR-155 MB及RS MB的靶向序列時，可產生強烈的熒光信號。RS+RS MB組熒光強度約為RS MB組的43倍，miR-155+miR-155 MB組熒光強度約為miR-155 MB組的58倍，兩組之間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而當有未對應的分子信標序列存在時，miR-155 MB及RS MB仍能保持穩(wěn)定的莖環(huán)結構，不受外界其他序列的干擾，與單獨存在miR-155 MB及RS MB組相比，無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

二、激光共聚焦檢測miR-155 MB對人肺癌組織中miR-155的識別成像功能

當加入miR-155 MB分子信標孵育冰凍肺癌組織后，鱗癌和腺癌組織中均可檢測到強度不同的紅色熒光信號，大部分表達部位在腫瘤的細胞漿，小部分在細胞核；而在陰性對照RS MB組中未檢測明顯熒光信號，極少部分顆粒樣熒光考慮雜質或非特異性染色，見圖1。

圖1miR-155 MB檢測對肺癌組織miR-155的識別成像功能(×400)

三、激光共聚焦檢測CS轉染miR-155 MB后及antagomir抑制后對肺癌細胞中miR-155的識別成像功能

在有miR-155 MB存在的條件下，各組細胞均可看到較強的紅色熒光信號，大部分定位在細胞漿，少數(shù)定位在細胞核。當加入miR-155的antagomir抑制劑后，由于miR-155的表達被抑制，激光共聚焦檢測發(fā)現(xiàn)熒光信號明顯降低，見圖2。

表1　雜交緩沖液中各組熒光強度 (mean±SD，n=5)

圖2CS轉染miR-155 MB及antagomir抑制后檢測對miR-155的識別成像功能(×800)

四、熒光強度分析

酶標儀檢測Cy5熒光強度發(fā)現(xiàn)，在miR-155 MB組，H446細胞中熒光強度最高，A549細胞熒光信號最弱。在加入miR-155的antagomir抑制劑后，熒光強度顯著降低，和未加antagomir抑制劑組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。表明本實驗所設計的miR-155分子信標能夠動態(tài)的監(jiān)測miR-155的表達變化，具有較高的靈敏性和特異性。

圖3酶標儀檢測A549、SPC-A1、H446細胞中各組熒光強度(×800)；注：P<0.05

討　　論

分子信標是一種分子內互補形成發(fā)卡結構的熒光標記的寡核苷酸序列，主要由4個部分組成：環(huán)、莖、熒光基團、淬滅基團。自然狀態(tài)下，分子信標為莖環(huán)結構，從而使得熒光基團和淬滅基團彼此靠近，熒光基團和淬滅基團可以發(fā)生熒光共振能量轉移，熒光基團發(fā)出的熒光分子被淬滅基團淬滅、吸收,從而無法產生熒光。當分子信標內的寡核苷酸與靶基因如DNA、RNA、miRNA序列結合后，分子信標的莖環(huán)結構打開，熒光基團與淬滅基團彼此分離，熒光基團發(fā)出的熒光不會被淬滅基團淬滅，從而發(fā)出熒光[8]。由于分子信標本身不會產生熒光，當存在目標DNA、RNA和miRNA時，分子信標才會與之雜交產生熒光，所以可以根據(jù)熒光強度及檢測熒光信號實現(xiàn)對靶DNA、RNA和miRNA進行實時成像和定量分析。分子信標技術非常靈敏，當和靶序列只有1個堿基的差別時，分子信標仍然保持莖環(huán)結構，不會產生熒光，可以檢測出一個堿基的差別，表明分子信標具有較高的特異性和靈敏性，為檢測細胞內基因突變及檢測細胞內基因表達變化提供了可能[9-10]。

分子信標設計原則是，環(huán)狀區(qū)一般由15～30個核苷酸組成，避免同源雜交，莖干區(qū)一般由5～8個堿基對組成，GC含量在70%至80%之間，5′端連接熒光染料，3′端連接淬滅劑；連接熒光基團的末端最好不用G，熒光基團需要能被淬滅基團特異性淬滅[11]。鎖核酸修飾的堿基可以提高分子信標的雜交能力及抗核酸酶能力，增加分子信標的穩(wěn)定性[12]。因此本研究基于以上特點設計了經過鎖核酸修飾的miR-155分子信標，同時以RS MB作為陰性對照。當miR-155 MB和RS MB單獨存在時，分子信標保持莖環(huán)結構。當與靶目標miR-155 及RS序列相遇后，莖環(huán)結構打開，可產生強烈的熒光信號。而當加入其它未對應的序列時，miR-155 MB和RS MB保持穩(wěn)定結構，熒光信號很弱。表明設計的miR-155 MB和RS MB具有高度的穩(wěn)定性、靈敏性、特異性。由于大量研究表明肺癌組織較正常組織高表達miR-155，我們選取了臨床肺鱗癌和腺癌組織標本各3例，當加入miR-155 MB分子信標孵育冰凍肺癌組織后，鱗癌和腺癌組織中均可檢測到強度不同的紅色熒光信號，表明在有miR-155存在時，miR-155分子信標可以與組織中的miR-155結合，從而導致熒光的產出。陰性對照組未檢測到熒光信號，表明我們設計的陰性對照RS MB不和其他基因組序列結合，具有較高的特異性，適合作為陰性對照。

由于分子信標本身是寡核苷酸，所以需要理想的轉運載體攜帶進入活細胞，理想的載體既可以保護分子信標被免于降解，又要在細胞內發(fā)揮靶向識別核酸序列的功能，以便對活細胞進行可視化研究。隨著納米科技迅猛發(fā)展，納米材料在醫(yī)學領域中的應用越來越廣泛[13]。納米殼聚糖可從自然界中大量獲取，毒性及免疫原性低，可以和RNA、DNA自組裝成穩(wěn)定的核殼結構，保護RNA、DNA不被血清酶降解，保證基因運送的效率和準確表達[14]，是分子信標理想的載體[7]。本研究發(fā)現(xiàn)在納米殼聚糖轉染miR-155 MB后，在miR-155 MB存在的條件下，由于肺癌細胞中均有miR-155的表達，各組細胞均可看到較強的紅色熒光信號。當加入miR-155的antagomir抑制劑后，由于miR-155的表達被抑制，激光共聚焦檢測發(fā)現(xiàn)熒光信號明顯降低，表明我們所設計的miR-155分子信標能夠動態(tài)的監(jiān)測肺癌細胞內miR-155的表達變化，具有較高的靈敏性和特異性。以上研究表明本研究利用分子信標技術實現(xiàn)了通過識別肺癌活細胞中的miR-155并成像肺癌細胞，從而為發(fā)現(xiàn)肺癌細胞并用于肺癌診斷提供了新的理論基礎。

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(本文編輯：王亞南)

朱海振，鄭召鵬，江飛龍，等. 基于分子信標技術對活細胞內miR-155檢測用于肺癌診斷[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2016， 9(4)： 361-365.

Detecting the miR-155 in living cells for lung cancer diagnoses based on molecular beacon technology

ZhuHaizhen1,ZhengZhaopeng1,JiangFeilong2,HanJing3,LiXuetao3,ChenGuangpeng3,LiHang1,ChenZhengtang2.

1DepartmentofOncology,GuizhouProvincialPeople'sHospital,Guiyang550002,China;2DepartmentofOncology,ChineseMedicineHospitalOfChongqing,Chongqing400037,China;3InstituteofCancer,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China

LiHang,Email:lihang.sy@163.com,ChenZhengtang,Email:czt05@163.com

ObjectiveDesigned the miR-155 molecular beacon (MB) which was modified by lock nucleic acid based on MB technology, detected and imaged the miR-155 in lung cancer cells by the laser confocal microscopy. MethodsDesigned the miR-155 MB which was modified by lock nucleic acid and the random sequence molecular beacon (RS MB) which was not complementary with any other sequences as the negative control. The specificity and sensitivity of the designed molecular beacon was detected by the hybridization assay and was verified in the lung cancer tissues. Chitosan(CS) nanoparticles were adopted to deliver the miR-155 MB. The laser confocal microscopy was used to detect and image the miR-155 or the miR-155 inhibited by the antagomir in lung cancer cells at the same time. ResultsHybridization assay showed that the fluorescence intensity in the miR-155+miR-155 MB group was 58 times higher than that in the only miR-155 MB group, and the fluorescence intensity in the RS+RS MB group was 431 times higher than that in the only RS MB group (P<0.05). The fluorescence signal could be detected in the lung cancer tissues and could not be detected in the RS MB group. The fluorescence signal could be detected in the lung cancer cells after CS transfect the miR-155 MB. The fluorescence signal was significantly decreased after the miR-155 expression was inhibited by the antagomir(P<0.05). ConclusionThe miR-155 MB could detect the miR-155 in the lung cancer cells and imaging them based on molecular beacon technology and provided new theoretical basis for diagnosis of lung cancer.

Lung neoplasms;Molecular beacon;microRNA

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.04.002

國家高技術發(fā)展研究計劃“863”項目(2008AA02Zl29)

國家自然科學基金面上資助項目(81071786)

550002 貴陽，貴州省人民醫(yī)院腫瘤科1

400015 重慶市中醫(yī)院腫瘤科2

李杭, Email：lihang.sy@163.com

陳正堂, Email：czt05@163.com

R734

A

2016-04-22)

400037 重慶，第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院全軍腫瘤研究所3