高　源, 朱春富, 張京平

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院 普外科, 江蘇 常州, 213000)

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水通道蛋白1在膽囊黏膜中的表達(dá)及臨床意義

高源, 朱春富, 張京平

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院 普外科, 江蘇 常州, 213000)

水通道蛋白1; 膽囊黏膜; 表達(dá)

膽囊炎是肝膽外科常見疾病，其主要病因為膽囊結(jié)石形成。膽囊炎主要病理表現(xiàn)為膽囊壁水腫，膽囊內(nèi)膽汁淤積或結(jié)石形成[1]。水通道蛋白-1(AQP-1)主要參與黏膜內(nèi)外水分的轉(zhuǎn)運，有報道[2]稱其表達(dá)同炎癥、腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性。本研究探討AQP-1與膽囊結(jié)石的相關(guān)性，現(xiàn)報告如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取2015年10—12月南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院普外科接受膽囊手術(shù)切除的患者64例，其中膽囊結(jié)石45例，膽囊息肉19例。45例膽囊結(jié)石中，急性膽囊炎20例，慢性膽囊炎25例。男21例，女43例，平均年齡(39.15±14.65)歲。

1.2方法

免疫組化: 6 μm切片，石蠟固定標(biāo)本，經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化。經(jīng)0.01 mol/L檸檬酸, 100℃下10 min抗原修復(fù)。3%的雙氧水消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，一抗(1∶500 稀釋, Abcam 公司，美國)4℃ 孵育過夜, PV9000 室溫孵育, DAB顯色，蘇木素復(fù)染。5%胎牛血清代替一抗為陰性對照。

蛋白提取及 Western blot 檢測：參照蛋白提取試劑盒(碧云天公司)說明書進(jìn)行。40 μg蛋白上樣后 80 V電泳，蛋白彌散后改為100 V繼續(xù)電泳，約 2 h。250 mA, 恒流濕轉(zhuǎn)，65 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后 5%BSA 封閉 2 h, 加入一抗(Abcam公司，美國)后4℃冰箱過夜。TBST洗膜3遍，每次15 min。 然后加入二抗后37℃恒溫箱孵育, TBST 洗膜 3 遍，每次15min。顯影液顯影，凝膠成像儀獲取圖像。

PT-PCR: 總 RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(大連寶生物公司)。反轉(zhuǎn)錄PCR引物由英濰捷基公司合成。AQP-1上游引物: 5-CTGTGGGATTAACCCTGCTC-3; 下游引物: 5- GGTCTGTGAGGTCACTGCTG-3; GAPDH 上游引物: 5- ACAACTTTGGCATTGTGGAA -3; 下游引物: 5- GATGCAGGGATGATGTTCTG -3。由Labnet PCR儀完成擴增。反應(yīng)條件: 95℃ 15 s 預(yù)變性，PCR 反應(yīng), 60℃ 20 s, 60℃ 20 s, 共40個循環(huán)。結(jié)果采用相對定量法分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析，各組間AQP-1及AQP-8表達(dá)陽性率的比較采用χ2檢驗。 Western blot 圖片用Image-J測灰度值; Western blot結(jié)果和RT-PCR結(jié)果均采用 Graphpad Prism5軟件，行單因素方差分析檢驗作圖。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　果

免疫組化顯示，有結(jié)石形成的膽囊黏膜中AQP-1表達(dá)陽性率為84%(38/45), 而在單純膽囊息肉的膽囊黏膜中AQP-1未見明顯表達(dá)。進(jìn)一步Western Blot檢驗結(jié)果顯示，結(jié)石形成的膽囊黏膜中AQP-1表達(dá)顯著高于正常膽囊(圖1)。針對AQP-1的mRNA檢測同樣存在上述表達(dá)差異(圖2)。

3　討　論

有報道[2-5]稱AQP-1同時還表達(dá)于膽囊、多種腫瘤組織中，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，其主要機制為促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變，進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞浸潤淋巴、血管等。Verkman等[6-10]通過對正常小鼠膽囊黏膜中AQP-1表達(dá)的研究闡述AQP-1廣泛存在于小鼠黏膜層，其主要作用是向膽囊腔內(nèi)分泌水分，然而這樣的水分未改變膽汁成分，故認(rèn)為AQP-1對膽囊結(jié)石形成無意義。本實驗通過對正常狀態(tài)、結(jié)石形成狀態(tài)下膽囊黏膜內(nèi)AQP-1的表達(dá)情況進(jìn)行檢測分析，結(jié)果顯示結(jié)石形成的膽囊黏膜內(nèi)AQP-1表達(dá)顯著高于正常膽囊組，且慢性炎癥組同急性炎癥膽囊黏膜組之間無顯著差異。針對AQP-1的mRNA表達(dá)測定同樣存在上述表達(dá)差異。

A. 在膽囊結(jié)石的膽囊黏膜表面表達(dá)陽性; B. 在膽囊息肉的膽囊黏膜表達(dá)陰性。圖1　AQP-1及AQP-8在不同狀態(tài)膽囊黏膜中的表達(dá)差異

AQP-1、AQP-8同時表達(dá)于膽囊黏膜內(nèi)[11-12]，AQP-1主要承載水的分泌功能，而AQP-8則充當(dāng)水分的重吸收功能。AQP-1在結(jié)石性膽囊黏膜中到表達(dá)增多的可能機制如下: ① 當(dāng)膽汁逐步黏稠層積，膽汁濃度增加，誘導(dǎo)黏膜內(nèi)AQP-1表達(dá)增強，促進(jìn)水分分泌，以達(dá)到稀釋膽汁，減緩結(jié)石形成。② AQP-1表達(dá)增強、促進(jìn)水分的分泌，使膽囊腫脹，膽囊收縮功能下降，致使膽汁層積，進(jìn)而演變?yōu)榻Y(jié)石形成。上述可能機制均表明AQP-1同膽囊結(jié)石形成存在一定的聯(lián)系。

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2016-04-15

江蘇省常州市科技計劃項目(CJ20140037)

張京平, E-mail: zjpcz2016@126.com

R 575.6

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1672-2353(2016)17-193-02

10.7619/jcmp.201617074