溫 軍，黃 慶，黃任澤

(廣東省湛江市林業(yè)良種繁育場，廣東 湛江 524300)

?

香樟組織培養(yǎng)及工廠化育苗技術(shù)研究

溫 軍，黃 慶，黃任澤

(廣東省湛江市林業(yè)良種繁育場，廣東 湛江 524300)

以健壯、無病蟲害的當(dāng)年優(yōu)生香樟樹新萌發(fā)出的嫩芽莖段為外植體進(jìn)行了組織培養(yǎng)工廠化育苗技術(shù)研究。結(jié)果表明：外植體以1%次氯酸鈉6 min+0.1%升汞7 min消毒時間較為佳；改良MS+6-BA1.0 mg/L+IBA0.1 mg/L是莖段誘導(dǎo)最合適的培養(yǎng)基；改良MS+6-BA1.2 mg/L+IBA0.1 mg/L+VC1.0 mg/L+PVP1.0 mg/L是理想的增殖培養(yǎng)基；在改良WPM+IBA0.5 mg/L+NAA0.5 mg/L+VC1.0 mg/L+PVP1.0 mg/L+活性炭0.1 mg/L中生根培養(yǎng)20 d后，單芽95%生根,移栽成活率達(dá)93%。

香樟；嫩芽；莖段；培養(yǎng)基；激素；生根

1　引言

香樟(Cinnamomumcamphora)古稱“豫章”，為樟科樟屬的亞熱帶常綠闊葉喬木,主要分布在臺灣和長江流域以南各地。香樟材質(zhì)優(yōu)良，紋理雅致，且含有特殊的香氣和揮發(fā)性油，具有耐水濕、抗腐、祛蟲等特點。該樹種枝葉茂密，冠大蔭濃，樹姿雄偉，能抗風(fēng)、吸煙滯塵、涵養(yǎng)水源、固土防沙和美化環(huán)境。香樟不僅是我國園林綠化、水源涵養(yǎng)和河提防護(hù)的良好樹種，同時也是珍貴用材和重要的經(jīng)濟(jì)樹種。

近年來，香樟作為優(yōu)良的鄉(xiāng)土闊葉樹種被廣泛應(yīng)用于綠化造林。目前，香樟采用扦插、嫁接等無性繁殖擴(kuò)繁較困難，且母株材料來源有限，無法滿足規(guī)模生產(chǎn)的需要。種子繁殖則實生苗后代分離嚴(yán)重，多數(shù)變異，且育苗時發(fā)芽遲緩，苗木參差不齊，而采用離體培養(yǎng)不僅能實現(xiàn)工廠化生產(chǎn)優(yōu)良香樟，而且能夠保持母本的優(yōu)良特性。為了更好地推進(jìn)香樟的生產(chǎn)發(fā)展，本試驗對香樟莖段不定芽的誘導(dǎo)、增值培養(yǎng)基和激素配比等影響香樟組織培養(yǎng)的因素進(jìn)行了初步的研究與探討，為香樟的工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

2　材料與試驗設(shè)計

2.1材料

本實驗的材料采自2011年湛江市林業(yè)良種繁育場營建的樟樹示范林。以健壯、無病蟲害的當(dāng)年優(yōu)生樹新萌發(fā)出的嫩芽莖段為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，去除葉片并修剪成約3 cm帶有腋芽的小段，先用清潔劑反復(fù)清洗2次，每次5 min，再用自來水沖洗30 min，然后進(jìn)行不同的消毒處理。

2.2試驗設(shè)計

2.2.1不同消毒時間對外植體的出芽率的影響

利用上述處理好的當(dāng)年優(yōu)生樹新萌發(fā)出的嫩芽莖段為外植體，在超凈工作臺上用75%酒精對外植體消毒10 s，無菌水清洗3遍，再用1%的次氯酸鈉6 min，無菌水清洗3遍，最后用0.1%升汞+吐溫80消毒處理3～9 min(0.1%升汞消毒時間分別為：3 min、5 min、7 min、9 min)，無菌水清洗6遍，放好備用。

2.2.2不同激素配比對外植體啟動的影響

將消毒好的材料切成1.5 cm的莖段，每段只帶有1個腋芽，接入不同激素配比的改良MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加的6-芐基氨基腺嘌呤(BA)分別為0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L,吲哚丁酸(IBA)的分別為0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L。每個處理接種30瓶外植體，先暗培養(yǎng)10 d，后轉(zhuǎn)光照培養(yǎng)，35 d后統(tǒng)計萌芽率。萌芽率=萌芽的外植體數(shù)/外植體數(shù)(無菌外植體)×100%。

2.2.3基本培養(yǎng)基的篩選

經(jīng)過初代培養(yǎng)3次(35 d繼代1次)后，將長勢相似的不定芽團(tuán)轉(zhuǎn)至添加6-BA1.0+IBA0.1的MS、改良MS(主要是降低硝酸鉀和硝酸銨的量、用硝酸鈣代替氯化鈣)、1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，研究其對香樟不定芽增值的影響。每個處理接種15瓶，每瓶接種4叢芽團(tuán)，所有處理均重復(fù)5次，35 d觀察并記錄苗的長勢、狀態(tài)，統(tǒng)計增殖倍數(shù)。

2.2.4不同激素配比對不定芽增殖的影響

經(jīng)過繼代培養(yǎng)5次(30 d繼代一次)后，將長勢相似的不定芽團(tuán)繼代到不同激素配比的改良MS培養(yǎng)基中，28 d后觀察并記錄苗的長勢、狀態(tài)，統(tǒng)計增殖倍數(shù)。上述每個處理接種15瓶，每瓶接種4叢芽團(tuán)，所有處理均重復(fù)3次。

2.2.5生根培養(yǎng)

將增殖培養(yǎng)35 d后，高1.5 cm以上的單芽(所選的芽健壯，葉片舒展，長度1.5～2 cm)切下，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。以改良的WPM為基本培養(yǎng)基，采用IBA4個激素水平(0.5 mg/L、 0.7 mg/L、1.0 mg/L、 1.2 mg/L)與NAA3個激素水平(0.1 mg/L、0. 3 mg/L、 0.5 mg/L)進(jìn)行正交設(shè)計，共12個處理。每處理接5瓶，每瓶接15棵，重復(fù)3次。接種22 d后，觀察并統(tǒng)計苗的生根率、生根數(shù)。生根率=生根苗數(shù)/接種單芽數(shù)量×100%。

2.2.6煉苗與移載

當(dāng)生根苗的根長到0.5 cm以上，把生根苗搬到帶有水簾的煉苗大棚開始煉苗。煉苗期間的11～16時用透光率50%的遮陽網(wǎng)遮擋陽光，其它時間段不遮擋。當(dāng)生根苗長至2～3 cm、具有6～8片葉、根系達(dá)到4～5條/根以上的完整植株，經(jīng)煉苗后，用清水清洗植株上粘附的培養(yǎng)基，0.2%百菌清清洗2 min，再栽種到紅心土的營養(yǎng)杯中進(jìn)行撫育管理，澆透水，保持小苗周圍空氣相對濕度在80%以上，用50%的遮蔭網(wǎng)拱形覆蓋膜保濕7 d左右，遮蔭30 d后進(jìn)行常規(guī)管理，50 d后統(tǒng)計成活率。

2.2.7組培各階段的基本培養(yǎng)條件及數(shù)據(jù)統(tǒng)計

接種后材料放在溫度25±3 ℃培養(yǎng)室中培養(yǎng)，每天光照10 h，光照強(qiáng)度為2000～2500lx。培養(yǎng)基均添加白砂糖30 g/L(生根培養(yǎng)基白砂糖20 g/L)、VC1.0 mg/L 、PVP1.0vm g/L、卡拉膠5.7 g/L，生根培養(yǎng)基添加活性炭0.1 g/L，pH值5.8。本試驗數(shù)據(jù)均為平均值。

3　結(jié)果與分析

3.1不同消毒時間對外植體的出芽率的影響

升汞易對外植體造成毒害，外植體出芽率、染菌率高低取決于其處理時間的長短。

表1結(jié)果表明：初代培養(yǎng)5 d后，可見無菌外植體頂芽伸長、有少量側(cè)芽萌動。培養(yǎng)35 d后培養(yǎng)基中大部分無菌材料能伸長萌芽，且大部分芽體、葉片呈綠色或淺綠色。培養(yǎng)35 d后， 0.1%升汞處理時間3 min污染率最高63%，轉(zhuǎn)綠時間最短，誘導(dǎo)率為100%，9 min的處理時間污染率最低3%， 15 d后轉(zhuǎn)綠，誘導(dǎo)為56%。5 min處理時間與7min處理時間較為合適。綜合污染率、回綠時間、萌芽率、誘導(dǎo)率等因素， 0.1%升汞處理時間為7 min較適宜。

表1　不同消毒時間對外植體的出芽率的影響

注：萌芽率=萌芽的外植體數(shù)/外植體數(shù)(無菌外植體)×100%；誘導(dǎo)率=出芽的外植體數(shù)/萌芽的外植體數(shù)×100%

3.2不同激素配比對外植體啟動的影響

本試驗主要通過添加不同細(xì)胞分裂素6-BA與生長素IBA的質(zhì)量濃度，以試驗不同激素配比對無菌外植體啟動誘導(dǎo)的的影響。從表2得出：培養(yǎng)基中隨著添加6-BA的量增加，不定芽誘導(dǎo)數(shù)量也隨之增加，但到2.0 mg/L時，有部分莖芽出現(xiàn)半透明狀，說明6-BA mg/L的量偏高，不利于腋芽的誘導(dǎo)啟動和培養(yǎng)。而添加IBA的量到0.1mg/L時誘導(dǎo)率達(dá)到最高，當(dāng)IBA的量到0.2 mg/L時，有的腋芽基部出現(xiàn)膨大愈傷化的現(xiàn)象，說明IBA的量不需要太高，高反而使激素水平偏向于愈傷的分化，誘導(dǎo)率反而下降。因此啟動誘導(dǎo)培養(yǎng)采用6-BA1.0 mg/L和IBA0.1 mg/L激素組合較好。

表2　不同激素配比對外植體啟動的影響

3.3基本培養(yǎng)基的篩選

大量的試驗證明基本培養(yǎng)基中大量元素的不同直接影響不定芽的培養(yǎng)與增殖。從表3可以看出：MS培養(yǎng)基中，有少量芽團(tuán)切口處有褐化現(xiàn)象，葉片呈淺綠色且彎曲，有少量靠近培養(yǎng)基葉片膨大，出現(xiàn)愈傷。改良MS的不定芽團(tuán)長勢良好，葉片整齊，呈綠色，增殖系數(shù)是最高的。1/2MS雖無褐化現(xiàn)象，但苗纖細(xì)，葉片呈黃色或棗紅色，增殖系數(shù)最低。因此改良MS培養(yǎng)基最適增殖和培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基。

表3　基本培養(yǎng)基的篩選

3.4不同激素對不定芽增殖的影響

增殖培養(yǎng)是離體快繁的優(yōu)勢階段，培養(yǎng)材料在短時間內(nèi)大量增殖，植物生長調(diào)節(jié)劑在試管苗增殖中起了重要的作用。通過6-BA與IBA調(diào)節(jié)，控制香樟不定芽在短時間內(nèi)即能穩(wěn)定、快速增殖，又不產(chǎn)生或少量產(chǎn)生變異的植株，為生根提供更多的有效芽(表4)。

表4　不同激素對不定芽增殖的影響

由表4可知，隨著添加6-BA的量增加，不定芽團(tuán)增殖倍數(shù)隨之增加，但添加至1.6 mg/L后，有部分莖芽出現(xiàn)彎曲、基部膨大、葉片半透明狀等現(xiàn)象，說明6-BA的量超過1.6 mg/L后屬于分裂素偏高，不利于不定芽的增殖和培養(yǎng)，可供生根的苗很少。當(dāng)BA的濃度不變，添加的IBA的質(zhì)量濃度達(dá)為0.05 mg/L時，香樟的增值率雖高，但芽團(tuán)成簇狀，苗長不高，可供生根的有效芽少；當(dāng)添加IBA的濃度達(dá)到0.2 mg/L時，有的不定芽團(tuán)基部出現(xiàn)膨大愈傷化，靠下的葉片出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，說明IBA的量太高，高激素水平反而使不定芽團(tuán)偏向于愈傷的分化，苗木出現(xiàn)玻璃化，增殖率反而下降。試驗表明，改良MS+6-BA1.2 mg/L+IBA0.1 mg/L是較理想的不定芽增殖培養(yǎng)基。

3.5生根培養(yǎng)基的篩選

以改良WPM為基本培養(yǎng)基，添加IBA四個激素水平，NAA三個激素水平，每個激素組合都接五瓶生根，每瓶15棵，培養(yǎng)22 d后統(tǒng)計生根苗的數(shù)量，生根率=生根苗數(shù)/接種單芽數(shù)量×100% ，培養(yǎng)結(jié)果如表5。

表5　生根培養(yǎng)基的篩選：

從生根培養(yǎng)試驗結(jié)果可知，香樟的生根率最低達(dá)到68%，最高可達(dá)100%。隨著IBA量增高，根的長短、粗細(xì)沒有太明顯的變化，根的數(shù)量有一定的增加。但隨著NAA的量達(dá)到0.3 mg/L，根的數(shù)量、長短、粗細(xì)都有明顯的變化。NAA的量越高，根的數(shù)量也隨之增加，根也變得又粗又短。綜合生根苗的狀態(tài)、長勢、生根率、粗細(xì)等因素，其中以改良WPM+IBA0.5 mg/L+ NAA0.5 mg/L培養(yǎng)基中的生根率較高，質(zhì)量最好。

3.6試管苗移載

試管苗移栽20 d左右開始生長，在戶外采用黃心土為基質(zhì)，50 d后統(tǒng)計成活率，移栽成活達(dá)93%。試驗期間發(fā)現(xiàn)，試管苗的移栽最好避開炎熱的6～9月，否則移栽成活率只有63%，冬季移栽一定注意蓋膜保溫。

4　結(jié)語

香樟優(yōu)良無性系組培工廠化育苗是解決當(dāng)前香樟優(yōu)良種苗缺乏的有效途徑，是實現(xiàn)香樟種苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的基礎(chǔ)。目前有不少香樟組培成功的報道，但不同學(xué)者間的觀點存在一定的分歧。

本研究結(jié)果表明，鹽度稍低的改良MS培養(yǎng)基(主要是降低硝酸鉀和硝酸銨的量、用硝酸鈣代替氯化鈣)比MS培養(yǎng)基更加適合香樟組培的工廠化生產(chǎn)，結(jié)論與吳金壽一致。在本研究篩選出的增值培養(yǎng)基(改良MS+6-BA1.2 mg/L+IBA0.1 mg/L+VC1.0 mg/L+PVP1.0 mg/L)進(jìn)行繼代培養(yǎng)，不僅繁殖系數(shù)高，而且成苗快，苗木整齊一致，質(zhì)量好，不須經(jīng)過壯苗培養(yǎng)，直接接種在改良WPM+IBA0.5 mg/L+NAA0.5 mg/L+VC1.0 mg/L+PVP1.0 mg/L+活性炭0.1 mg/L中生根培養(yǎng)生根率達(dá)95%，移栽成活率達(dá)93%。經(jīng)試驗，筆者初步建立了香樟優(yōu)良無性系繼代增值培養(yǎng)與壯苗培養(yǎng)同步進(jìn)行，以及一步生根、一步移栽成苗的組培快繁體系。

[1]王長憲，劉靜，黃艷艷，等.山東抗寒香樟組培快繁體系的建立[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2006，37(4)：513～516.

[2]鄭紅建.香樟組培快繁技術(shù)研究[J].林業(yè)科技開發(fā)，2012，26(1)：103～105.

[3]曾令海，連輝明，張謙，等.香樟資源及其開發(fā)利用[J].廣東林業(yè)科技，2012，28(3)：62～66.

[4]容世清，曾少玲.馬占相思工廠化組培育苗技術(shù)的研究[J].熱帶林業(yè)，1997，25(2)：55～58.

[5]吳幼媚，王以紅，蔡玲，等.香樟優(yōu)良無性系快繁技術(shù)的研究[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)，2006，25(1)：60～64.

2016-06-30

溫軍(1983—)，男，助理工程師，主要從事植物組織培養(yǎng)及加勒比松雜交育種工作。

S792

A

1674-9944(2016)15-0098-04