郭櫻子，欒亞楠，周玉玲，白承連，任湘鵬

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)室中心，浙江　溫州　325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué)　環(huán)境與公共衛(wèi)生學(xué)院，浙江　溫州　325035）

?

低劑量氯氟氰菊酯對(duì)斑馬魚胚胎運(yùn)動(dòng)行為的影響

郭櫻子1，欒亞楠1，周玉玲1，白承連2，任湘鵬1

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)室中心，浙江溫州325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境與公共衛(wèi)生學(xué)院，浙江溫州325035）

目的：研究低劑量氯氟氰菊酯對(duì)斑馬魚胚胎運(yùn)動(dòng)行為的影響。方法：用0、10、20、40、80、100 μg/L的氯氟氰菊酯對(duì)斑馬魚胚胎進(jìn)行處理，進(jìn)行畸形表型及濃度效應(yīng)分析。研究0、2.5、5、10 μg/L的低劑量氯氟氰菊酯對(duì)斑馬魚胚胎自主運(yùn)動(dòng)、接觸反應(yīng)、自由泳動(dòng)等運(yùn)動(dòng)行為的影響。結(jié)果：氯氟氰菊酯暴毒斑馬魚胚胎的主要畸形表型為心包囊腫大、脊柱和尾部彎曲、卵黃囊腫大等。與對(duì)照組比，20 μg/L及以上濃度暴露下斑馬魚胚胎的畸形率顯著提高（P＜0.05），而10 μg/L氯氟氰菊酯對(duì)斑馬魚胚胎無明顯致畸效應(yīng)。氯氟氰菊酯在胚胎受精后120 h（120 hpf）的半數(shù)致畸濃度（EC50）為38.61 μg/L。運(yùn)動(dòng)行為檢測(cè)結(jié)果顯示，2.5 μg/L暴露下斑馬魚胚胎的自主運(yùn)動(dòng)頻率在19、21和22 hpf時(shí)顯著升高（P＜0.05），10 μg/L氯氟氰菊酯暴露下胚胎的自主運(yùn)動(dòng)頻率在20和21 hpf時(shí)顯著下降（P＜0.05），且峰值由21 hpf延遲到22 hpf；5、10 μg/L組胚胎在27和48 hpf時(shí)對(duì)接觸反應(yīng)的運(yùn)動(dòng)距離呈顯著下降（P＜0.05）；10 μg/L氯氟氰菊酯顯著降低了仔魚的自由泳動(dòng)速度（P＜0.01）。結(jié)論：氯氟氰菊酯對(duì)斑馬魚胚胎有嚴(yán)重的致畸效應(yīng)，且呈現(xiàn)劑量依賴性。對(duì)斑馬魚胚胎無明顯致畸效應(yīng)的低劑量氯氟氰菊酯即可顯著影響其自主運(yùn)動(dòng)、接觸反應(yīng)、自由泳動(dòng)等發(fā)育早期的運(yùn)動(dòng)行為。

氯氟氰菊酯；斑馬魚；胚胎發(fā)育；運(yùn)動(dòng)行為

擬除蟲菊酯類殺蟲劑是在天然除蟲菊素基礎(chǔ)上迅速發(fā)展的一類高效安全的新型農(nóng)藥，廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物及衛(wèi)生害蟲的防治。研究表明菊酯類殺蟲劑具有神經(jīng)毒性［1］，發(fā)育期的神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)某些特異性菊酯類殺蟲劑更加敏感［2］。有報(bào)道稱孕婦、兒童甚至嬰幼兒尿液中均含有擬除蟲菊酯類農(nóng)藥代謝產(chǎn)物［3］，提示嬰幼兒在生長發(fā)育階段也會(huì)處于低濃度水平擬除蟲菊酯類殺蟲劑的暴露之中。因此，有必要研究模擬環(huán)境水平的低劑量擬除蟲菊酯類殺蟲劑的發(fā)育神經(jīng)毒性效應(yīng)。

斑馬魚具有體型小、易飼養(yǎng)繁殖、體外受精、產(chǎn)卵量大、胚胎透明、發(fā)育快等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，其神經(jīng)系統(tǒng)與人類非常相似，相關(guān)基因與人類神經(jīng)系統(tǒng)的同源基因具有高度保守性，是一種良好的發(fā)育神經(jīng)毒性評(píng)價(jià)模型［4］。相對(duì)于傳統(tǒng)的死亡、畸形等毒理學(xué)指標(biāo)，神經(jīng)行為學(xué)指標(biāo)更加敏感特異，是發(fā)育神經(jīng)毒性評(píng)價(jià)的一項(xiàng)重要指標(biāo)［5］。斑馬魚在正常發(fā)育早期逐步出現(xiàn)自主運(yùn)動(dòng)、接觸反應(yīng)和自由泳動(dòng)等幾個(gè)穩(wěn)定的運(yùn)動(dòng)行為特征［6］，特別適合于高通量篩選的行為學(xué)評(píng)價(jià)［7］。本研究以斑馬魚胚胎為研究對(duì)象，選擇I I型擬除蟲菊酯類殺蟲劑的典型代表氯氟氰菊酯為受試物，考察低劑量氯氟氰菊酯對(duì)斑馬魚胚胎運(yùn)動(dòng)行為的影響，為進(jìn)一步確認(rèn)其發(fā)育神經(jīng)毒性提供基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1主要試劑：氯氟氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%，美國Sigma公司），二甲基亞砜（DMSO）（純度＞99%，碧云天生物技術(shù)有限公司），其他試劑均為分析純。1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：無病原體AB品系斑馬魚（引自美國Oregon州立大學(xué)）

1.1.3主要設(shè)備：全封閉斑馬魚循環(huán)養(yǎng)殖孵化系統(tǒng)（美國AHAB公司），光照恒溫培養(yǎng)箱（RXZ-300C，寧波江南儀器廠），體式顯微鏡（Nikon SMZ1500，上海千欣儀器有限公司），斑馬魚行為分析系統(tǒng)（Video Track 3.5，法國Viewpoint Life Science公司），精密電子天平（Satorius BS124S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），旋渦混合器（XW-80，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠），超純水器（UPWS-1-20T，杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司），pH計(jì)（Delta 320，上海峰至儀器有限公司）。

1.2方法

1.2.1斑馬魚飼養(yǎng)及胚胎收集：斑馬魚飼養(yǎng)在全封閉斑馬魚循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行，早晚定時(shí)喂食鹽水豐年蟲幼體，中午喂食成魚顆粒狀飼料。飼養(yǎng)水溫為（26±1）℃，pH值為6.5～7.5，光周期為14 h光照、10 h黑暗。胚胎收集前1天晚上將健康性成熟斑馬魚按雌雄1∶1配對(duì)放入孵化箱內(nèi)混養(yǎng)，次日早上燈亮后0.5 h開始收集。胚胎收集完，經(jīng)清洗、挑選后移入斑馬魚胚胎培養(yǎng)液中，于28 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)待用。按照Kimmel等［8］描述對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育階段進(jìn)行分期。

1.2.2氯氟氰菊酯毒液的配制及半數(shù)致畸濃度（EC50）測(cè)定：稱取適量氯氟氰菊酯粉末溶于DMSO，配制成高濃度貯備液，再用DMSO分別稀釋成不同濃度的母液，置于4 ℃冰箱備用。實(shí)驗(yàn)前，分別用胚胎培養(yǎng)液將不同濃度的母液稀釋1 000倍，配制成染毒工作液（此工作液中的DMSO濃度為0.1%，該濃度對(duì)胚胎發(fā)育無顯著影響）。參照文獻(xiàn)［9］報(bào)道的氯氟氰菊酯對(duì)斑馬魚胚胎的暴露濃度，設(shè)置6個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度組，分別為：0（對(duì)照組）、10、20、40、80、100 μg/L。使用96孔無菌細(xì)胞培養(yǎng)板作為染毒器具，每孔分別加入300 μL上述濃度的氯氟氰菊酯溶液，放入1枚經(jīng)鏡檢發(fā)育正常的受精后6 h（6 hpf）的胚胎，并置于28 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，染毒至120 hpf。每個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度組用40枚胚胎。染毒期間每2 d更換毒液，加蓋后用保鮮膜封好以避免實(shí)驗(yàn)濃度的改變。每隔24 h在體式顯微鏡下觀察胚胎發(fā)育，挑出死亡和畸形胚胎，并記錄數(shù)目。畸形胚胎包括色素發(fā)育不全、孵化不成功、脊柱彎曲、尾部彎曲、卵黃囊腫大、心包囊腫大、游囊關(guān)閉、身體側(cè)翻、腦部壞死等。記錄120 hpf時(shí)各個(gè)染毒濃度組的畸形胚胎總數(shù)（包含死亡胚胎數(shù)），畸形率=畸形胚胎數(shù)/胚胎總數(shù)。該實(shí)驗(yàn)用不同批次和親本來源的斑馬魚胚胎重復(fù)4次。調(diào)用SPSS軟件中的概率單位模型估算氯氟氰菊酯的EC50大小。

1.2.3自主運(yùn)動(dòng)分析［10］：參照氯氟氰菊酯的濃度效應(yīng)分析（10 μg/L濃度對(duì)斑馬魚胚胎無致畸效應(yīng)），將胚胎分為4組，分別用0、2.5、5、10 μg/L氯氟氰菊酯暴毒處理，每組20枚健康胚胎。染毒方法同上。自主運(yùn)動(dòng)記錄在室溫27～28 ℃下適應(yīng)5 min后進(jìn)行，在裝有CCD的體式顯微鏡下錄像，記錄從18 hpf至25 hpf（每小時(shí)記錄1次）1 min內(nèi)斑馬魚胚胎的自主運(yùn)動(dòng)（表現(xiàn)為尾部自主的左右擺動(dòng)），計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 接觸反應(yīng)分析［11］：染毒方法同上。以氯氟氰菊酯濃度為0、2.5、5、10 μg/L進(jìn)行暴露染毒，每組20枚健康胚胎。在27和48 hpf時(shí)期，用專用小針輕輕碰觸斑馬魚尾部背側(cè)，進(jìn)行接觸反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，以對(duì)接觸刺激做出逃生反應(yīng)的胚胎運(yùn)動(dòng)的距離為終值進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5運(yùn)動(dòng)活力分析［10］：挑選正常發(fā)育的6 hpf階段的胚胎，分別加入到含不同濃度氯氟氰菊酯（0、2.5、5、10 μg/L）的96孔板中，每孔300 μL毒液及1枚胚胎，每組24枚健康胚胎。光照培養(yǎng)箱中暴毒培養(yǎng)到96 hpf后，在顯微鏡下觀察仔魚的發(fā)育情況，將無明顯畸形及其他行為異常的個(gè)體經(jīng)胚胎培養(yǎng)液漂洗，脫毒后轉(zhuǎn)入到有新鮮培養(yǎng)液的24孔板中，每孔2 mL 培養(yǎng)液及1個(gè)仔魚，恢復(fù)培養(yǎng)至120 hpf，用于運(yùn)動(dòng)活力分析。檢測(cè)前在體視顯微鏡下觀察仔魚的游囊及發(fā)育行為和運(yùn)動(dòng)姿勢(shì)是否正常（異常個(gè)體行為不納入統(tǒng)計(jì)范圍）。仔魚在行為分析儀Zebrabox中適應(yīng)10 min后，在Tracking模式下檢測(cè)仔魚自由泳動(dòng)，運(yùn)動(dòng)活力檢測(cè)時(shí)間為20 min。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)作圖采用GraphPad Prism 6軟件完成。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s的方式給出，方差齊性檢驗(yàn)采用Levene檢驗(yàn)，多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較方差齊者采用LSD Least-significant dif-ference）檢驗(yàn)，方差不齊者進(jìn)行Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1氯氟氰菊酯對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的畸形效應(yīng)氯氟氰菊酯暴毒斑馬魚胚胎中普遍存在的畸形效應(yīng)為心包囊腫大、脊柱和尾部彎曲、卵黃囊腫大、身體側(cè)翻等，見圖1A。暴露于氯氟氰菊酯的胚胎在120 hpf時(shí)的畸形率具有劑量依賴效應(yīng)，即與暴露濃度成正比（見圖1B）。與對(duì)照組相比，20 μg/L及以上濃度暴露下斑馬魚胚胎的畸形率顯著提高（P ＜0.05），100 μg/L暴露下斑馬魚胚胎的畸形率增加到（87.50±6.21）%（P＜0.01），10 μg/L氯氟氰菊酯對(duì)斑馬魚胚胎無明顯致畸效應(yīng)。概率單位法估算氯氟氰菊酯的EC50=38.61 μg/L，95%置信區(qū)間為31.84～46.71 μg/L。

圖1　氯氟氰菊酯染毒斑馬魚胚胎120 hpf時(shí)的畸形表型及劑量效應(yīng)分析

圖2　低劑量氯氟氰菊酯染毒斑馬魚胚胎在18～25 hpf時(shí)期1 min內(nèi)自主運(yùn)動(dòng)次數(shù)（n=20）

2.2低劑量氯氟氰菊酯對(duì)斑馬魚胚胎自主運(yùn)動(dòng)的影響 對(duì)照組胚胎18～21 hpf期間自主運(yùn)動(dòng)頻率逐漸增加，而在21～25 hpf期間自主運(yùn)動(dòng)頻率逐漸下降（見圖2）。在18 hpf時(shí)自主運(yùn)動(dòng)頻率為3.02± 0.38，在21 hpf時(shí)達(dá)到峰值7.48±0.59，而在25 hpf時(shí)又下降至3.84±0.28。與對(duì)照組相比，2.5μg/L暴露下斑馬魚胚胎的自主運(yùn)動(dòng)頻率在18～23 hpf時(shí)均表現(xiàn)為上升趨勢(shì)，在19 hpf時(shí)顯著升高至4.98±0.28（P＜0.05），21 hpf時(shí)的高峰值顯著升高至8.48±0.63（P＜0.05），22 hpf時(shí)顯著上升至6.12±0.56（P＜0.05）；而在24～25 hpf時(shí)的自主運(yùn)動(dòng)頻率略微下降。與之相反，10 μg/L氯氟氰菊酯暴露下胚胎的自主運(yùn)動(dòng)頻率在18～21 hpf時(shí)均較對(duì)照組表現(xiàn)為下降趨勢(shì)，20 hpf時(shí)顯著下降至4.81±0.56（P＜0.05），21 hpf時(shí)顯著下降至4.96±0.38（P＜0.05）；值得注意的是，10 μg/L氯氟氰菊酯暴露下，胚胎的自主運(yùn)動(dòng)頻率高峰值由21 hpf延遲到22 hpf，且高峰值降至6.02±0.65。5 μg/L氯氟氰菊酯對(duì)斑馬魚胚胎18～25 hpf期間的自主運(yùn)動(dòng)頻率無明顯影響。

2.3低劑量氯氟氰菊酯對(duì)斑馬魚胚胎接觸反應(yīng)的影響 與對(duì)照組相比，暴露于各個(gè)低濃度氯氟氰菊酯的胚胎在27、48 hpf時(shí)對(duì)接觸反應(yīng)的運(yùn)動(dòng)距離基本呈下降趨勢(shì)，見圖3。在27 hpf，對(duì)照組胚胎對(duì)接觸反應(yīng)的運(yùn)動(dòng)距離為78.48±14.19，而5、10 μg/L組胚胎的運(yùn)動(dòng)距離顯著下降至49.38±7.96 （P＜0.05）和24.16±6.42（P＜0.01）；在48 hpf，對(duì)照組對(duì)接觸反應(yīng)的運(yùn)動(dòng)距離為158.79±25.32，而5、10 μg/L組胚胎則顯著下降至81.31±15.63 （P＜0.01）和73.25±12.46（P＜0.01）。2.5 μg/L氯氟氰菊酯對(duì)斑馬魚胚胎的接觸反應(yīng)無明顯影響。

圖3　低劑量氯氟氰菊酯對(duì)斑馬魚胚胎接觸反應(yīng)的影響（n=20）

2.4低劑量氯氟氰菊酯對(duì)斑馬魚仔魚運(yùn)動(dòng)活力的影響 6～96 hpf期間暴露于低劑量氯氟氰菊酯的胚胎，在120 hpf的仔魚運(yùn)動(dòng)活力見圖4。對(duì)照組仔魚自由泳動(dòng)的平均速度為（1.96±0.14）mm/s，2.5、5、10 μg/L組的平均運(yùn)動(dòng)速度分別為2.06±0.22，1.68±0.30和1.41±0.14（P＜0.01），10 μg/L氯氟氰菊酯顯著降低了仔魚的自由泳動(dòng)速度。

圖4　低劑量氯氟氰菊酯染毒下斑馬魚仔魚自由泳動(dòng)的平均速度（n=24）

3　討論

隨著擬除蟲菊酯殺蟲劑的使用量不斷增加，其潛在的人體健康風(fēng)險(xiǎn)問題越來越受到關(guān)注，特別是對(duì)嬰幼兒等敏感人群神經(jīng)發(fā)育的影響。Demicco等［9］首次利用斑馬魚模型研究了6種菊酯類農(nóng)藥的發(fā)育神經(jīng)毒性。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明，對(duì)斑馬魚胚胎無明顯致畸效應(yīng)的低劑量氯氟氰菊酯（10 μg/L）即可顯著影響其自主運(yùn)動(dòng)、接觸反應(yīng)、自由泳動(dòng)等發(fā)育早期的運(yùn)動(dòng)行為，提示低劑量菊酯類殺蟲劑具有潛在的發(fā)育神經(jīng)毒性。

本研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)育早期（6～120 hpf）暴露于氯氟氰菊酯導(dǎo)致斑馬魚胚胎出現(xiàn)一系列畸形表型，多種畸形效應(yīng)往往同時(shí)出現(xiàn)在較高濃度染毒組，各組畸形效應(yīng)在72 hpf時(shí)開始出現(xiàn)，到120 hpf時(shí)畸形率增加。本研究中畸形表型分析與其他學(xué)者的研究結(jié)果基本一致，如王健等［12］發(fā)現(xiàn)，在48 hpf以后，經(jīng)高效氯氰菊酯溶液處理的胚胎會(huì)表現(xiàn)出不同程度的毒性反應(yīng)，包括體軸彎曲、心包囊腫、獨(dú)眼和死亡，在0.1 mg/L濃度下，畸形率顯著增加。徐永學(xué)等［13］研究發(fā)現(xiàn)氯氰菊酯暴露組斑馬魚胚胎在24 hpf前形態(tài)上未出現(xiàn)明顯異常，48 hpf以后表現(xiàn)出體軸彎曲、心包囊腫等不同程度的毒性反應(yīng)癥狀。另外，本研究的劑量效應(yīng)分析表明，10 μg/L氯氟氰菊酯對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育無明顯影響，為后續(xù)研究氯氟氰菊酯的低劑量效應(yīng)提供了準(zhǔn)確的濃度設(shè)置范圍。由于我們采用96孔板進(jìn)行暴露和培養(yǎng)，避免了胚胎之間的交叉感染等因素，因而劑量結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。

本研究重點(diǎn)考察了低劑量氯氟氰菊酯對(duì)斑馬魚胚胎運(yùn)動(dòng)行為的影響，以此來間接反應(yīng)其發(fā)育神經(jīng)毒性效應(yīng)。胚胎尾部的自主運(yùn)動(dòng)是斑馬魚發(fā)育的初期運(yùn)動(dòng)特征，運(yùn)動(dòng)信號(hào)直接由脊椎神經(jīng)元傳出而不經(jīng)過腦部神經(jīng)［6］。17 hpf時(shí)，功能神經(jīng)元與體節(jié)相連接，斑馬魚胚胎開始自主運(yùn)動(dòng)，而后隨著運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，這種非神經(jīng)中樞控制的運(yùn)動(dòng)就逐漸減少［14］。與之一致，本研究中對(duì)照組胚胎從自主運(yùn)動(dòng)發(fā)生開始，到21 hpf時(shí)該運(yùn)動(dòng)頻率達(dá)到一個(gè)峰值，再逐漸減少。本研究結(jié)果還顯示低劑量氯氟氰菊酯暴露可改變斑馬魚的自主運(yùn)動(dòng)頻率，表現(xiàn)為2.5 μg/L暴露可顯著上調(diào)19、21、22 hpf期的自主運(yùn)動(dòng)；而10 μg/L暴露則顯著抑制20～21 hpf期的自主運(yùn)動(dòng)，且10 μg/L染毒組胚胎自主運(yùn)動(dòng)到達(dá)峰值的時(shí)間延遲了1 h，表明低劑量氯氟氰菊酯對(duì)胚胎發(fā)育有短時(shí)間的抑制作用，這可能與軀干肌肉或神經(jīng)支配異常有關(guān)［14］。其他研究學(xué)者也報(bào)道過類似的研究結(jié)果，如Jim等［15］研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的聯(lián)苯菊酯染毒可顯著提高斑馬魚胚胎24 hpf期的自主運(yùn)動(dòng)頻率，這與本研究中2.5 μg/L氯氟氰菊酯暴露對(duì)胚胎自主運(yùn)動(dòng)的影響相似。Huang等［10］利用斑馬魚胚胎研究了全氟辛烷磺酸的行為毒性效應(yīng)，結(jié)果表明對(duì)照組胚胎在18 hpf時(shí)自主運(yùn)動(dòng)能夠達(dá)到峰值，而全氟辛烷磺酸染毒組的峰值延遲1至2 h，同樣說明其對(duì)胚胎發(fā)育有短暫抑制效應(yīng)。對(duì)發(fā)育中的哺乳動(dòng)物的神經(jīng)行為效應(yīng)研究表明，菊酯類農(nóng)藥可特異性作用于電壓敏感鈉離子通道而導(dǎo)致神經(jīng)毒性［2］，其對(duì)斑馬魚胚胎自主運(yùn)動(dòng)的影響是否由于通過靶向鈉離子通道而引起尚需進(jìn)一步研究。

在斑馬魚的發(fā)育過程中，胚胎對(duì)于接觸刺激的反應(yīng)開始于21 hpf，在27 hpf時(shí)得到進(jìn)一步的發(fā)育完善［6］，它被認(rèn)為是斑馬魚逃避反應(yīng)的發(fā)育開端。接觸反應(yīng)是在斑馬魚尾部受到刺激后，Rohon-Beard感覺神經(jīng)元迅速興奮，引起脊柱運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元及其支配的肌肉纖維的共同作用下產(chǎn)生的運(yùn)動(dòng)行為［16］。本研究表明，5、10 μg/L氯氟氰菊酯處理組斑馬魚胚胎在27、48 hpf時(shí)接觸反應(yīng)的運(yùn)動(dòng)距離顯著低于對(duì)照組。其他不同化合物對(duì)斑馬魚胚胎接觸反應(yīng)的影響也有過類似報(bào)道，如有研究表明，與對(duì)照組相比，四溴雙酚A染毒組斑馬魚在27、36、48 hpf時(shí)的接觸反應(yīng)能力顯著降低［11］。不同濃度的雷帕霉素暴露對(duì)斑馬魚胚胎的接觸反應(yīng)能力有顯著影響，低濃度表現(xiàn)為促進(jìn)，而高濃度表現(xiàn)為抑制［17］。Rohon-Beard感覺神經(jīng)元迅速進(jìn)入活化狀態(tài)是接觸反應(yīng)的細(xì)胞基礎(chǔ)，多種神經(jīng)毒物的暴露可引起斑馬魚Rohon-Beard感覺神經(jīng)元的發(fā)育缺陷［18］。因此，本研究中低劑量氯氟氰菊酯的暴露可能引起早期發(fā)育期斑馬魚Rohon-Beard感覺神經(jīng)元的損傷，使其對(duì)尾部的刺激變得遲鈍，導(dǎo)致其對(duì)接觸刺激無法做出迅速反應(yīng)。菊酯類殺蟲劑對(duì)斑馬魚胚胎接觸反應(yīng)相關(guān)神經(jīng)元的損傷作用及機(jī)制尚需深入研究。

正常發(fā)育的斑馬魚仔魚在96～120 hpf階段開始陸續(xù)出現(xiàn)張開的游囊組織，由卵黃囊提供營養(yǎng)和能量，使其具有自由泳動(dòng)的能力，其運(yùn)動(dòng)能力也最能反應(yīng)環(huán)境污染物質(zhì)對(duì)機(jī)體造成的代謝，神經(jīng)及肌肉等組織或器官功能的毒性［5］。為了進(jìn)一步研究低劑量氯氟氰菊酯對(duì)于斑馬魚神經(jīng)行為的影響，我們考察了在光照條件下20 min內(nèi)仔魚的平均運(yùn)動(dòng)速度。結(jié)果表明，10 μg/L氯氟氰菊酯暴露即可顯著降低仔魚的自由泳動(dòng)速度。與本研究類似，Jim等［15］研究了不同濃度的聯(lián)苯菊酯對(duì)斑馬魚仔魚運(yùn)動(dòng)活力的影響，結(jié)果表明，3～84 hpf時(shí)期暴露于50、100、200 μg/L聯(lián)苯菊酯的斑馬魚胚胎，在96 hpf時(shí)期的運(yùn)動(dòng)活力呈顯著下降。而值得注意的是，Huang等［10］的研究表明，自6 hpf染毒至96 hpf后脫毒的仔魚，第5天的泳速隨濃度的升高呈“倒U型”，而僅僅在144 hpf時(shí)染毒1 h的仔魚，泳速隨濃度升高而升高，這種效應(yīng)在其他幾種神經(jīng)毒物中也同樣出現(xiàn)［19］。相對(duì)長時(shí)間染毒導(dǎo)致的仔魚運(yùn)動(dòng)活力下降與肌肉組織受損及神經(jīng)肌肉協(xié)調(diào)性阻斷有關(guān)［20］，因此，本研究中10 μg/L氯氟氰菊酯較長時(shí)間暴露可能損害了斑馬魚胚胎的肌肉組織與其神經(jīng)肌肉的協(xié)調(diào)性，其具體神經(jīng)機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

［1］RAY D E， FRY J R. A reassessment of the neurotoxicity of pyrethroid insecticides［J］. Pharmacol Ther， 2006， 111（1）：174-193.

［2］SHAFER T J， MEYER D A， CROFTON K M. Developmental neurotoxicity of pyrethroid insecticides： critical review and future research needs［J］. Environ Health Perspect，2005， 113（2）： 123-136.

［3］LU C， BARR D B， PEARSON M A， et al. The attribution of urban and suburban children's exposure to synthetic pyrethroid insecticides： a longitudinal assessment［J］. J Expo Sci Environ Epidemiol， 2009， 19（1）： 69-78.

［4］LEIN P， LOCKE P， GOLDBERG A. Meeting report： alternatives for developmental neurotoxicity testing［J］. Environ Health Perspect， 2007， 115（5）： 764-768.

［5］SELDERSLAGHS I W， HOOYBERGHS J， DE C W， et al. Locomotor activity in zebrafi sh embryos： a new method toassess developmental neurotoxicity［J］. Neurotoxicol Teratol，2010， 32（4）： 460-471.

［6］SAINT A L， DRAPEAU P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafi sh embryo［J］. J Neurobiol，1998， 37（4）： 622-632.

［7］RIHEL J， PROBER D A， ARVANITES A， et al. Zebrafi sh behavioral profiling links drugs to biological targets and rest/wake regulation［J］. Science， 2010， 327 （5963）： 348-351.

［8］KIMMEL C B， BALLARD W W， KIMMEL S R， et al. Stages of embryonic development of the zebrafi sh［J］. Dev Dyn，1995， 203（3）： 253-310.

［9］DEMICCO A， COOPER K R， RICHARDSON J R， et al. Developmental neurotoxicity of pyrethroid insecticides in zebrafi sh embryos［J］. Toxicol Sci， 2010， 113 （1）： 177-186.

［10］HUANG H， HUANG C， WANG L， et al. Toxicity， uptake kinetics and behavior assessment in zebrafi sh embryos following exposure to perfluorooctanesulphonicacid （PFOS）［J］. Aquat Toxicol， 2010， 98（2）： 139-147.

［11］白承連, 鄭易, 李星馳, 等. 四溴雙酚A對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育毒性和神經(jīng)毒性研究[J]. 中國藥事, 2013, 27(3): 292-297.

［12］王健, 劉麗麗, 余凱敏, 等. 高效氯氰菊酯對(duì)斑馬魚胚胎毒性的研究[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2014, 10: 223-229.

［13］徐永學(xué), 劉麗麗, 王健, 等. β-氯氰菊酯對(duì)斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性[J]. 中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志, 2013, 27(2): 256-262.

［14］FRAYSSE B， MONS R， GARRIC J. Development of a zebrafish 4-day embryo-larval bioassay to assess toxicity of chemicals［J］. Ecotoxicol Environ Saf， 2006， 63（2）： 253-267.

［15］JIM M， ZHANG X， WANG L， et al. Developmental toxicity of bifenthrin in embryo-larval stages of zebrafish［J］. Aquat Toxicol， 2009， 95（4）： 347-354.

［16］BRUSTEIN E， SAINT A L， BUSS R， et al. Steps during the development of the zebrafi sh locomotor network［J］. J Physiol Paris， 2003， 97（1）： 77-86.

［17］陳將飛, 馬雪, 蓋增鑫, 等. 雷帕霉素(RAP)對(duì)斑馬魚胚胎的發(fā)育、運(yùn)動(dòng)行為和免疫毒性的影響[J]. 環(huán)境化學(xué), 2014, 33(4): 556-561.

［18］JACOBSON S M， BIRKHOLZ D A， MCNAMARA M L，et al. Subacute developmental exposure of zebrafi sh to the organophosphate pesticide metabolite， chlorpyrifos-oxon，results in defects in Rohon-Beard sensory neuron development［J］. Aquat Toxicol， 2010， 100（1）： 101-111.

［19］IRONS T D， MACPHAIL R C， HUNTER D L， et al. Acute neuroactive drug exposures alter locomotor activity in larval zebrafish［J］. Neurotoxicol Teratol， 2010， 32（1）： 84-90.

［20］FENT K， MEIER W. Tributyltin-induced effects on early life stages of minnows Phoxinus phoxinus［J］. Arch Environ Contam Toxicol， 1992， 22（4）： 428-438.

（本文編輯：趙翠翠，丁敏嬌）

Effect of low-dose cyhalothrin on motor behavior in zebrafi sh embryos

GUO Yingzi1, LUAN Ya’nan1, ZHOU Yuling1, BAI Chenglian2, REN Xiangpeng1. 1.Laboratory Center, the Eye Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 2.School of Public Health and Environment, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective: To study the effects of low-dose cyhalothrin on motor behavior in zebrafish embryos. Methods: The dose-response effects and malformation phenotype were evaluated by observing zebrafi sh embryos exposed to different concentrations of 0， 10， 20， 40， 80， 100 μg/L cyhalothrin solutions. The impact of low-dose of 0， 2.5， 5， 10 μg/L cyhalothrin on several motor behaviors in zebrafi sh embryos was then explored，including embryonic spontaneous movement， touch response and larval swimming speed. Results: The predominant malformation phenotypes observed in surviving embryos were edema of pericardialsac， bent spine， curved tail and yolk sac edema. Compared with the control group， zebrafi sh embryos exposed to 20 μg/L and above concentrations showed signifi cantly increased malformation rate （P＜0.05）， while 10 μg/L cyhalothrin exhibited no infl uence on embryonic development. Cyhalothrin concentration that led to 50% malformations （EC50） of the embryos at 120 hours post fertilization （hpf） was 38.61 μg/L. A series of motor behavior tests revealed that embryos exposed to 2.5 μg/L cyhalothrin displayed remarkably elevated spontaneous movement frequency at 19， 21 and 22 hpf （P＜0.05）， while this frequency was decreased in embryos treated with 10 μg/L cyhalothrin at 20-21 hpf （P＜0.05）； besides， 5， 10 μg/L cyhalothrin exposure induced markedly reduction of touch response movement in zebrafi sh embryos at both 27 and 48 hpf （P＜0.05）； moreover， 10 μg/L cyhalothrin reduced larval swimming movement speed at 120 hpf （P＜0.01）. Conclusion: Cyhalothrin causes severe embryonic toxicity in a dosedependent manner. Low dose of cyhalothrin exposure which shows no effect on embryonic development signifi -cantly alters several motor behaviors at early life stage.

cyhalothrin； zebrafi sh； embryonic development； motor behavior

R994.6

A DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2016.07.002

2016-01-18

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31101680）；溫州醫(yī)學(xué)院科研啟動(dòng)項(xiàng)目（QTJ09019）。

郭櫻子（1993-），女，湖北仙桃人，碩士生。

任湘鵬，副研究員，Email：renxpeng@wmu.edu.cn。