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        電針合谷穴對窒息大鼠心肺復(fù)蘇后神經(jīng)功能及生存率的影響

        2016-09-29 02:22:56梁小燕莊永敬曹云飛周黎明
        關(guān)鍵詞:膽堿能合谷中樞

        房 巍,梁小燕,莊永敬,曹云飛,周黎明

        · 論著| ORIGINAL ARTICLES ·

        電針合谷穴對窒息大鼠心肺復(fù)蘇后神經(jīng)功能及生存率的影響

        房 巍1,梁小燕1,莊永敬2,曹云飛1,周黎明1

        目的 觀察電針刺激合谷穴對窒息大鼠心肺復(fù)蘇(cardiopulmonary resuscitation,CPR)后神經(jīng)功能及生存率的影響。方法 采用呼氣末夾閉氣管窒息法建立大鼠心臟停跳CPR模型,雄性SD大鼠隨機分為四組:(1)CPR對照組(C組):右側(cè)腦室注射生理鹽水(5 μl);(2)甲硝阿托品處理組(A組):右側(cè)腦室注射甲硝阿托品(5 μg/kg);(3)單純電針刺激處理組(E組):電針刺激合谷穴+右側(cè)腦室注射生理鹽水;(4)電針刺激加甲硝阿托品處理組(EA組):電針刺激合谷穴+右側(cè)腦室注射甲硝阿托品。其中每組8只大鼠用于神經(jīng)功能觀察,窒息時間5 min,分別于自主循環(huán)恢復(fù)(restoration of spontaneous circulation,ROSC)后24、48、72 h進行神經(jīng)功能缺損評分(neurological deficit scores,NDS);12只大鼠用于生存率觀察,窒息時間8 min,每隔2 h記錄ROSC后72 h內(nèi)的存活情況。結(jié)果 ROSC后24 h和48 h,四組間NDS評分整體比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.828,P=0.281;χ2=3.728,P=0.292)。ROSC后72 h,四組間NDS評分整體比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.710,P=0.033);進一步兩兩比較顯示,E組NDS評分高于C組(P=0.015),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。C組、E組、A組及EA組72 h生存率分別為25.00%(3/12)、66.67%(8/12)、16.67%(2/12)和33.33%(4/12)。組間比較顯示:E組72 h生存率高于C組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.874,P=0.049)。結(jié)論 電針刺激合谷穴可有效提高窒息大鼠CPR后的神經(jīng)功能和生存率,其作用可能與激活中樞膽堿能系統(tǒng)功能有關(guān)。

        電針;窒息;心肺復(fù)蘇;神經(jīng)功能;生存率

        隨著心肺復(fù)蘇(cardiopulmonary resuscitation,CPR)技術(shù)的普及和改進,心跳驟停后的復(fù)蘇率有了明顯提高,20%~50%患者經(jīng)及時有效的CPR后能夠恢復(fù)自主 循 環(huán)(restoration of spontaneous circulation,ROSC)。但由于復(fù)蘇后持續(xù)的腦損傷存在,使得其最終生存率和整體預(yù)后仍不理想,文獻[1,2]報道其出院率僅為2%~15%,而40%~50%存活患者將遭受永久性的認知功能損害,可見腦復(fù)蘇是CPR最后成敗的關(guān)鍵。近來有研究發(fā)現(xiàn),CPR后中樞膽堿能信號通路功能顯著下降,并導(dǎo)致膽堿能抗炎功能減低和神經(jīng)功能障礙,而應(yīng)用膽堿能受體激動劑則可明顯降低復(fù)蘇后的神經(jīng)炎性反應(yīng)和神經(jīng)元損傷[3]。筆者所在課題組既往研究顯示,電針刺激外周穴位(如內(nèi)關(guān)、合谷)可通過激活中樞膽堿能受體功能而增強機體的迷走抗炎作用,明顯減少致死性內(nèi)毒素血癥大鼠的炎性介質(zhì)釋放,并顯著提高其生存率[4]。但對于電針刺激是否可通過激活中樞膽堿能系統(tǒng)功能而改善窒息大鼠CPR后的神經(jīng)功能及生存率,目前尚未見報道。為此,本研究通過建立窒息大鼠心跳驟停和CPR模型,以觀察電針刺激外周合谷穴是否有助于改善復(fù)蘇后的神經(jīng)功能及生存率。

        1 材料與方法

        1.1 材料 雄性清潔級SD大鼠80只,體質(zhì)量180~250 g,購自廣東省實驗動物中心,合格證號2011A035,術(shù)前禁食12 h。立體定位儀和雙線示波器(Narishige,日本),動物呼吸機(浙江醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器實驗廠),LH202H韓氏電針刺激儀(北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司),甲硝阿托品(atropine methyl nitrate,購自San Bruno,CA)。

        1.2 分組 用于神經(jīng)功能或存活率觀察的大鼠均隨機分為四組:(1)CPR對照組(C組),右側(cè)腦室注射生理鹽水5 μl;(2)甲硝阿托品處理組(A組),右側(cè)腦室注射甲硝阿托品5 μg/kg,生理鹽水稀釋成5 μl,以阻斷中樞的膽堿能毒蕈堿受體功能[4];(3)單純電針刺激處理組(E組),電針刺激雙側(cè)合谷穴+右側(cè)腦室注射生理鹽水;(4)電針刺激加甲硝阿托品處理組(EA組),電針刺激雙側(cè)合谷穴+右側(cè)腦室注射甲硝阿托品。其中每組用于神經(jīng)功能觀察的大鼠(n=8),窒息時間5 min,分別于ROSC后24、48、72 h進行神經(jīng)功能缺損評分(neurological deficit scores,NDS);用于生存率觀察的大鼠(n=12),窒息時間8 min,72 h內(nèi)每隔2 h記錄ROSC后的存活情況。

        1.3 動物模型的制備 大鼠術(shù)前禁食不禁水12 h,根據(jù)國外Hendrickx[5]和國內(nèi)高昌俊等[6]研究建立窒息法CPR模型:將動物仰臥固定于手術(shù)臺上,稱重后腹腔內(nèi)注射3%戊巴比妥鈉40 mg/kg誘導(dǎo)麻醉,麻醉完全后將大鼠固定于立體定位儀上,行右股動、靜脈插管,連接壓力傳感器后計算機監(jiān)測血壓,兩前肢皮下插入針頭并連接心電極以監(jiān)測心電圖。經(jīng)口插入自制氣管導(dǎo)管(16 G),接小動物呼吸機行機械通氣,靜脈注射維庫溴銨2 mg/kg以消除自主呼吸,通氣頻率80 次/min,潮氣量6 ml/kg。根據(jù)Paxinos&Watson腦立體定位圖譜確定右側(cè)側(cè)腦室的位置(前囟后-0.8 mm,旁開1.5 mm,深度4.0 mm),緩慢勻速(5 μl/3 min)注射5 μl無菌生理鹽水或甲硝阿托品溶液,留針5 min后緩慢拔針。穩(wěn)定5 min后于呼氣末夾閉氣管導(dǎo)管,分別窒息5或8 min,然后立即實施CPR,行機械通氣,同時給予人工胸外心臟按壓,按壓頻率為160 次/min,按壓深度為大鼠胸廓前后徑的1/3,并快速靜脈注射腎上腺素0.02 mg/kg和5%碳酸氫鈉1 mmol/kg。心跳驟停定義為平均動脈壓(mean arterial pressure,MAP)<20 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa),而出現(xiàn)自主心率且MAP>50 mmHg并持續(xù)10 min為ROSC,復(fù)蘇10 min無效者為復(fù)蘇失敗。自主呼吸恢復(fù)正常后拔除氣管導(dǎo)管,待大鼠清醒后結(jié)扎股動、靜脈,縫合皮膚切口,送回鼠籠。

        1.4 電針刺激 電針刺激選取雙側(cè)合谷穴,取穴標(biāo)準及針刺深度參照中國針灸學(xué)會實驗針灸研究會華興邦《大鼠穴位圖譜的研制》[7],在大鼠前肢第一和第二掌骨之間取合谷穴(Li-4),刺入深度5 mm,雙側(cè)合谷穴分別與同側(cè)皮膚各接一對電極,同時連接LH202H韓氏電針刺激儀。電針刺激參數(shù):強度4 mA,選用疏密波,頻率2~100 Hz,持續(xù)時間45 min。

        1.5 NDS 按照Geocadin的NDS評價神經(jīng)功能[8],評分的具體內(nèi)容包括總體表現(xiàn)、腦干功能、運動評估、感覺評估、運動平衡、行為學(xué)及驚厥等方面,評分范圍為80分(完全正常)至0分(腦死亡)。

        1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以x±s表示,組間比較采用單因素方差分析;計數(shù)資料以百分率表示,采用Kaplan-Meire估計各組生存率;神經(jīng)功能評分以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)[M(Q)]表示,組間比較采用Kruska1-Wallis H檢驗,如組間差別有統(tǒng)計學(xué)意義,兩兩比較采用重新編秩次后的LSD檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 一般情況 四組大鼠實施CPR前體重、心率、平均動脈壓組間比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,見表1。

        表1 各組大鼠一般情況比較(n=20;x±s)

        2.2 各組大鼠NDS評分比較 ROSC后24 h和48 h,四組間NDS評分整體比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.828,P=0.281;χ2=3.728,P=0.292)。ROSC后72 h,四組間NDS評分整體比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.710,P=0.033);進一步兩兩比較顯示,E組NDS評分高于C組(P=0.015),差異有統(tǒng)計學(xué)意義,見表2。

        表2 ROSC后各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較[n=8;分;M(Q)]

        2.3 72 h生存率比較 C組、E組、A組及EA組72 h生存率分別為25.00%(3/12)、66.67%(8/12)、16.67%(2/12)與33.33%(4/12)。組間比較顯示:E組72 h生存率高于C組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.874,P=0.049)。見圖1。

        圖1 四組大鼠的72 h生存率比較

        3 討論

        心跳驟停致循環(huán)停止后,機體的各組織器官即出現(xiàn)嚴重的缺血缺氧、組織細胞損傷、甚至死亡現(xiàn)象。其中腦組織對缺血缺氧的天然脆弱性使得其在心跳驟停后的損傷最為嚴重。全腦缺血后,小膠質(zhì)細胞和巨噬細胞很快被激活,導(dǎo)致細胞毒性物質(zhì)產(chǎn)生和釋放增加,如細胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、一氧化氮、氧自由基等,這些細胞毒性物質(zhì)可進一步破壞血腦屏障,并引起神經(jīng)元受損死亡,臨床上即表現(xiàn)出神經(jīng)功能障礙,嚴重者出現(xiàn)昏迷、持續(xù)植物狀態(tài)甚至死亡[2,3]。

        近年來的研究發(fā)現(xiàn),膽堿能系統(tǒng)對于機體維持正常中樞和外周免疫反應(yīng)十分重要[9],而心跳驟停后的膽堿能和免疫失調(diào)則會破壞機體組織的修復(fù)和康復(fù)。Norman等[10]研究顯示,中樞膽堿能神經(jīng)主要分布在缺氧缺血的易損區(qū),如海馬、紋狀體和皮質(zhì)等部位。窒息大鼠心跳驟停經(jīng)復(fù)蘇后,中樞膽堿能通路的許多細胞成分出現(xiàn)了改變,包括乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(choline acetyltransferase,ChAT)活性降低,ChAT陽性神經(jīng)元數(shù)量減少,乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase, AChE)和囊泡乙酰膽堿轉(zhuǎn)運體活性均降低,而應(yīng)用α7煙堿型乙酰膽堿受體選擇性激動劑可明顯降低復(fù)蘇后神經(jīng)炎性反應(yīng)和神經(jīng)元損傷。中樞膽堿能信號傳導(dǎo)通路對于調(diào)節(jié)迷走傳出神經(jīng)的興奮性及其抗內(nèi)毒素血癥作用中也起著中樞啟動和調(diào)控的關(guān)鍵作用[11,12]。本課題組前期針刺研究證實,針刺合谷穴可通過激活中樞的毒蕈堿受體,激活迷走傳出神經(jīng)而發(fā)揮抗內(nèi)毒素血癥的作用,明顯減少致死性內(nèi)毒素血癥大鼠的炎性介質(zhì)釋放,并顯著提高生存率。應(yīng)用中樞交感神經(jīng)興奮抑制藥(可樂定)并不能阻斷電針的保護作用,而腦室內(nèi)注射M型膽堿能受體阻斷藥(甲硝阿托品)則可阻斷電針的保護作用,顯示電針合谷穴是激活中樞膽堿能抗炎通路的有效途徑[4]。

        本研究對窒息誘導(dǎo)的心臟驟停大鼠CPR后即刻予合谷穴電針刺激,發(fā)現(xiàn)可明顯改善其72 h神經(jīng)功能缺損評分,并明顯增加生存率。但EA組(電針刺激加甲硝阿托品處理組)與單純C組相比,72 h神經(jīng)功能缺損評分及生存率均無統(tǒng)計學(xué)差異,提示腦室注射M型膽堿能受體阻斷劑可基本消除電針刺激的保護作用,表明合谷穴電針刺激有可能是通過激活中樞膽堿能通路而減輕心臟驟停CPR后大鼠的腦損傷、改善復(fù)蘇后的腦功能和存活率。但電針刺激的作用可能更為廣泛,而并不局限于對中樞膽堿能功能的影響。如王少錦等[13]采用電針刺激擬阿爾茨海默病 (Alzheimer's disease,AD)大鼠的督脈穴,發(fā)現(xiàn)其可增強腦內(nèi)抗氧化能力,減輕腦內(nèi)自由基對神經(jīng)元的損傷,提高中樞膽堿能系統(tǒng)功能(如大腦皮層和海馬區(qū)的AChE和ChAT活性),緩解擬AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。周利等[14]研究顯示對缺血性腦損傷,針刺具有改善其腦組織氧代謝,調(diào)節(jié)異常的生物電活動,改善腦血管功能,增加腦血流量,抗興奮毒性,抗自由基損傷,抑制細胞因子,防止細胞內(nèi)鈣超載和抑制細胞凋亡等廣泛作用。因而,電針合谷穴對窒息大鼠CPR后的神經(jīng)保護作用是否也存在其他的作用機制,還有待進一步探討。

        綜上所述,窒息大鼠CPR后予合谷穴位電針刺激,無論是從生存率還是神經(jīng)功能缺陷評分上看,都能起到有益作用,其機制可能與電針刺激激活中樞膽堿能系統(tǒng)功能而減輕神經(jīng)炎性反應(yīng)和神經(jīng)元損傷有關(guān)。

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        [6]高昌俊,張貴和,孫緒德,等. 大鼠窒息性心跳停止復(fù)蘇后腦缺血損傷模型的建立[J]. 臨床麻醉學(xué)雜志,2012, 28(1): 77-80.

        [7]華興邦,李辭蓉,周浩良,等.大鼠穴位圖譜的研制[J].實驗動物與動物實驗, 1991(1): 1-5.

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        [14]周 利,鄭國慶,王明杰.針刺對缺血性腦損傷保護作用的分子機制研究進展[J]. 中國針灸, 2003, 23(5): 303-305.

        (2016-06-13 收稿 2016-08-01 修回)

        (責(zé)任編輯 張亞麗)

        Effect of electroacupuncture at Hegu acupoints on survival and neurological function after cardiopulmonary resuscitation in asphyxial cardiac arrest rats

        FANG Wei1, LIANG Xiaoyan1, ZHUANG Yongjing2, CAO Yunfei1, and ZHOU Liming1. 1. Department of Emergency, 2. Department of General Burn Surgery, The 421th Hospital of Chinese People's Liberation Army, Guangzhou 510318,China

        CAO Yunfei, E-mail: caoyunfeicn@sina.com

        Objective To investigate effect of electroacupuncture at Hegu acupoints on survival rate and neurological function after cardiopulmonary resuscitation in asphyxia1 cardiac arrest rats. Methods Asphyxial cardiac arrest was induced with asphyxia by clamping the tracheal tubes. Male Sprague-Dawley rats were randomly divided into five groups: (1) cardiopulmonary resuscitation group(group C), with right intracerebroventricular injection of 5 μl physiologic saline; (2) atropine methyl nitrate administered group (group A),with right intracerebroventricular injection of atropine methyl nitrate (5 μg/kg); (3) electroacupuncture administered group (group E), with electroacupuncture at Hegu acupoints and right intracerebroventricular injection of physiologic saline; (4) electroacupuncture plus atropine methyl nitrate group (group EA), with electroacupuncture at Hegu acupoints and right intracerebroventricular injection of atropine methyl nitrate. 8 rats in each group were used for neural function observation. They were subjected to 5 minutes of asphyxial cardiac arrest, and then neurological deficits were evaluated and scored at 24, 48 and 72 h respectively after restoration of spontaneous circulation (ROSC). 12 rats in each group were used for survival study. They were also subjected to 8 minutes of asphyxial cardiac arrest, and then survival conditions were observed every 2 h within 72 h after ROSC. Results At 24 h and 48 h after ROSC, the differences in neurological deficitscores (NDS) among all four groups was not statistically significant(χ2=3.828, P=0.281; χ2=3.728, P=0.292), but at 72 h after ROSC,NDS showed statistically significant differences among four groups. And then further pairwise comparison showed that NDS in group E was significantly higher than that in group C, and the difference was statiscally significant (P=0.015). Survival rate within 72 h of group C, group E, group A and group EA were 25% (3/12),66.67% (8/12), 16.67% (2/12) and 33.33% (4/12), respectively. Survival rate within 72 h of group E was higher than that of group C, the difference was statistically significant (χ2=3.874, P=0.049). Conclusions Electroacupuncture at Hegu acupoints can increase survival rate and improve neurological function after cardiopulmonary resuscitation in asphyxial cardiac arrest rats, which is probably related with activating central cholinergic system.

        electroacupuncture; asphyxia; cardiopulmonary resuscitation; neurological function; survival rate

        R245

        10.13919/j.issn.2095-6274.2016.09.001

        廣東省中醫(yī)藥局科研課題(20151039);

        全軍“十二五”醫(yī)學(xué)創(chuàng)新專項課題(13CXZ045);

        2014年度全軍醫(yī)學(xué)科技青年培育項目計劃(14QNP047)

        房 巍,碩士,主治醫(yī)師,E-mail: 2109388@qq.com

        510318 廣州,解放軍421醫(yī)院:1.急診科,2.普通燒傷外科

        曹云飛,E-mail: caoyunfeicn@sina.com

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