張雪輝，唐 蕊，魏洪亮

（1.邢臺(tái)學(xué)院化學(xué)工程與生物技術(shù)學(xué)院 河北邢臺(tái) 054001； 2.保定市農(nóng)業(yè)局 河北保定 071000）

黃瓜枯萎病是由半知菌亞門尖鐮孢菌黃瓜?；停‵usarium oxysporumf.sp.cucumerinumOwen.）所引起的一種在全球范圍內(nèi)傳播的土傳真菌病害，該病一般可造成黃瓜產(chǎn)量下降10%～30%，嚴(yán)重時(shí)可致使黃瓜產(chǎn)量下降80%～90%，對(duì)黃瓜產(chǎn)量有很大影響[1-2]。近年來隨著黃瓜種植面積的增長(zhǎng)，由連作重茬而引起的黃瓜枯萎病日漸嚴(yán)重。在實(shí)際生產(chǎn)中除了選用抗病品種、結(jié)合輪作倒茬和嫁接等栽培管理之外，使用藥劑防治是黃瓜枯萎病防治的重要方法，但當(dāng)前因缺乏安全有效的藥劑，極易造成農(nóng)藥殘留，從而危害人畜健康及環(huán)境安全。生物防治是目前研究克服土傳病害的重要方向，主要利用拮抗微生物及其產(chǎn)生的代謝物進(jìn)行植物病害的預(yù)防與治理，又以其安全和高效的特點(diǎn)日益引起人們的關(guān)注[3-4]。筆者以從多年種植黃瓜的土壤中分離得到的對(duì)黃瓜枯萎病拮抗作用較好的菌株GK-6為試驗(yàn)材料，通過試驗(yàn)找出GK-6菌株抗菌代謝物產(chǎn)生的最佳培養(yǎng)條件，為開發(fā)新型生物藥劑提供理論依據(jù)，進(jìn)而為黃瓜的綠色生產(chǎn)保駕護(hù)航。

1 材料與方法

1.1 材料

拮抗菌GK-6、黃瓜枯萎病菌菌株均由邢臺(tái)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

培養(yǎng)基為馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（LB）、LB液體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 母液制備 將保存的菌種GK-6轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基平板上活化，24h后接種于100mL液體培養(yǎng)基中，然后在28℃、170 rpm振蕩條件下培養(yǎng)24 h,經(jīng)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)得到密度為4.2×108cfu·mL-1的懸浮液，置于4℃冰箱保存，作為母液備用[5]。

1.2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響 將母液按1∶20的比例接種于盛有100 mL LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，并分為7組，培養(yǎng)條件設(shè)置為28℃下170 rpm振蕩培養(yǎng)，之后分別在8、16、24、32、40、48、56 h 時(shí)取出離心，無菌過濾，保留濾液。將牛津杯放置于混有黃瓜枯萎病菌的PDA平板上，每牛津杯中加入20μL濾液，每處理10次重復(fù)，在28℃培養(yǎng)48 h后測(cè)量抑菌圈直徑[6-7]。

1.2.3 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響 將100 mL LB液體培養(yǎng)基用1 mol·L-1HCl或1 mol·L-1NaOH 調(diào)節(jié) pH 值至 5、6、7、8、9、10 標(biāo)記后滅菌。每瓶加入5mL母液，在搖床上28℃、170rpm條件下振蕩培養(yǎng)48 h，取出離心過濾，測(cè)定濾液抑菌活性，方法同1.2.2。

1.2.4 培養(yǎng)溫度對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響 將5 mL母液分別加入到盛有100 mL LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，分別在 24、28、30、32、36 ℃和 170 rpm條件下培養(yǎng)48 h，然后取出離心過濾，測(cè)定濾液抑菌活性，方法同1.2.2。

1.2.5 接種量對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響 將母液分別以 0、0.5、1、3、5、7、10 mL 的接種量加到100 mL的LB液體培養(yǎng)基中，在28℃、170 rpm條件下培養(yǎng)48 h，然后取出離心過濾，測(cè)定濾液抑菌活性，方法同1.2.2。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株GK-6發(fā)酵液抑菌活性的影響

從圖1可看出，菌株GK-6發(fā)酵液抑菌活性最初隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸提高，培養(yǎng)到40 h時(shí)抑菌圈直徑達(dá)到最大值28 mm，隨后抑菌活性則開始下降。結(jié)果表明，其最佳發(fā)酵時(shí)間應(yīng)為40 h。

圖1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株GK-6發(fā)酵液抑菌活性的影響

2.2 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)菌株GK-6發(fā)酵液抑菌活性的影響

由圖2可知，培養(yǎng)基的初始pH對(duì)菌株GK-6的抑菌活性影響較大。當(dāng)pH處于5～7之間時(shí)隨著pH的增大，抑菌活性會(huì)明顯增強(qiáng)，在pH=7時(shí)抑菌圈直徑達(dá)到了最大值27.9 mm，pH=8時(shí)略有下降，抑菌圈直徑為27.0 mm，當(dāng)pH處于8～10之間時(shí)，抑菌活性明顯下降。結(jié)果表明，pH 7～8的弱堿性培養(yǎng)條件是菌株GK-6抗菌物質(zhì)產(chǎn)生的較適條件。

圖2 初始pH值對(duì)菌株GK-6發(fā)酵液抑菌活性的影響

2.3 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株GK-6發(fā)酵液抑菌活性的影響

由圖3可以看出，隨著培養(yǎng)溫度的增加，GK-6菌株抑菌活性逐漸增強(qiáng)，溫度到達(dá)30℃時(shí)抑菌活性最高，達(dá)到28.1 mm，之后抑菌活性會(huì)隨著溫度的升高而逐漸下降。結(jié)果表明，30℃是其抗菌物質(zhì)產(chǎn)生的最佳溫度。

圖3 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株GK-6發(fā)酵液抑菌活性的影響

2.4 接種量對(duì)菌株GK-6發(fā)酵液抑菌活性的影響

從圖4可知，不同的接種量對(duì)GK-6抑菌活性影響較大，最初隨著接種量的增加,GK-6發(fā)酵液的抑菌活性增高,當(dāng)接種量為5 mL時(shí)GK-6的抑菌活性達(dá)到最高,抑菌圈直徑達(dá)28.8 mm,而后隨著接種量增大,抑菌活性反而降低。結(jié)果表明，接種量為5 mL，即接種量為5%（φ，下同）時(shí)其抑菌活性最強(qiáng)。究開發(fā)階段。

圖4 接種量對(duì)菌株GK-6發(fā)酵液抑菌活性的影響

本研究結(jié)果表明拮抗菌GK-6產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的最佳培養(yǎng)條件是培養(yǎng)液初始pH 7～8，接種比例為5%時(shí)，在30℃，170 rmp振蕩培養(yǎng)40 h。雖然該結(jié)果僅僅是通過室內(nèi)搖瓶培養(yǎng)而得到的，不能直接轉(zhuǎn)化為實(shí)際工業(yè)化生產(chǎn)的參考依據(jù)，但仍具有一定的參考價(jià)值，為其商品化開發(fā)奠定了一定的基礎(chǔ)[10]。為充分發(fā)揮生防菌的潛力做好準(zhǔn)備，對(duì)GK-6的特性及其有效使用劑量、使用時(shí)間等問題還需進(jìn)一步研究。

3 討論與結(jié)論

連茬和重茬使得黃瓜枯萎病發(fā)生日趨嚴(yán)重，特別是保護(hù)地栽培表現(xiàn)尤為明顯，成為黃瓜生產(chǎn)中的毀滅性病害。培育和應(yīng)用抗病品種是防治此病害最經(jīng)濟(jì)有效的措施。但由于枯萎病抗源材料不足，傳統(tǒng)育種方法周期長(zhǎng)，抗性品種有限。雖然采用傳統(tǒng)育種方法和細(xì)胞工程、基因工程等現(xiàn)代生物技術(shù)相結(jié)合以選育抗枯萎病新品種在西瓜抗病育種取得了重大突破，但在黃瓜上還需時(shí)日。因此，栽培上絕大部分仍是感病品種[8]。在追求食品品質(zhì)的今天，隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，生物源農(nóng)藥的研發(fā)成為熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外針對(duì)黃瓜枯萎病展開的生防菌研究越來越熱，目前在生產(chǎn)上應(yīng)用的主要有真菌、細(xì)菌、放線菌等，其應(yīng)用主要是活菌制劑和抗生素兩種。世界上成功應(yīng)用的有芬蘭的一種活體制劑My-costop和我國(guó)的由細(xì)黃鏈霉菌制成的“5406”[9]。目前生防菌的研究大多數(shù)處于待研