王吉明，尚建立，李 娜，徐永陽，馬雙武

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所 鄭州 450009）

西瓜純度鑒定在種質(zhì)資源研究、新品種選育和生產(chǎn)應(yīng)用上具有重要意義，傳統(tǒng)的西瓜純度鑒定方法為表型性狀鑒定，通過觀察西瓜表型性狀在生長(zhǎng)發(fā)育期的變化而對(duì)純度做出判斷，受環(huán)境影響較大，存在鑒定周期長(zhǎng)、準(zhǔn)確性差、鑒定效率低等局限性［1-6］，而同工酶鑒定多態(tài)性不夠豐富，且有組織和器官特異性等缺點(diǎn)[7]。近年來隨著以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展，不少作物實(shí)現(xiàn)了分子標(biāo)記快速鑒定純度，將純度鑒定工作由田間轉(zhuǎn)移到室內(nèi)，極大地提高了鑒定效率。在西瓜作物上前人先后開展過利用RAPD、SRAP、SSR等分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行純度鑒定的研究［8-13］，其中基于全基因組測(cè)序信息開發(fā)的SSR核心引物為分子標(biāo)記技術(shù)在西瓜純度鑒定上的實(shí)際應(yīng)用提供了重要的支持［14］。

利用分子標(biāo)記進(jìn)行純度鑒定通常對(duì)樣品逐株進(jìn)行分析，而在西瓜雜交種子純度鑒定工作中，雜株通常較少，如果通過將一定數(shù)量的單株混合后檢測(cè)混合樣品中是否存在雜株分子標(biāo)記位點(diǎn)來對(duì)混合樣品的整體純度進(jìn)行判定，可以大幅度減少鑒定工作量，如在小麥分子標(biāo)記純度鑒定研究上通過合理混合樣品，將100粒種子的DNA合并為20個(gè)混合樣本，使工作量減少了4/5［15］，從而顯著提高了鑒定效率，但目前國(guó)內(nèi)外在西瓜純度鑒定研究上尚未有類似的報(bào)道，為此筆者對(duì)不同類型的西瓜樣品混合后進(jìn)行 dCaps（Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences，衍生型酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列）標(biāo)記鑒定的比較研究，擬尋找合適的混合株數(shù)，為提高西瓜純度的分子標(biāo)記鑒定效率提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2016年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所進(jìn)行，材料來自西瓜甜瓜種質(zhì)資源平臺(tái)（國(guó)家西瓜甜瓜中期庫）。以枯萎病抗性種質(zhì)‘Su garlee’即“純株”和枯萎病感病種質(zhì)‘14CB11’即“雜株”為材料，分別取新鮮真葉葉片和干燥真葉葉片備用。干燥真葉制備方法為：取新鮮真葉后置于國(guó)家西瓜甜瓜中期庫種質(zhì)保存冷庫中（溫度5℃，相對(duì)濕度40%）低溫干燥72 h后成為干燥真葉。

1.2 方法

通過在‘Sugarlee’樣品（“純株”）中添加不同比例的‘14CB11’樣品（“雜株”），比較不同添加比例對(duì)分子標(biāo)記純度鑒定結(jié)果的影響。

1.2.1 葉片混合樣品方法 按照表1進(jìn)行不同比例的抗病材料和感病材料的真葉混合，其中新鮮真葉總混合樣品質(zhì)量分為0.1g和0.5g，干燥真葉總混合樣品質(zhì)量分為0.01g和0.05g，混合樣品后提取DNA。

表1 西瓜葉片量混樣比例表(雜株葉片量：總量混合葉片量)

1.2.2 DNA混合樣品方法 取0.1g新鮮真葉提取DNA，稀釋成100 ng·μL-1，按照感病材料提取DNA量占總混合 DNA 量的體積比為 1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 和 1∶100 進(jìn)行 DNA 混合。

1.2.3 DNA提取方法 采用天根DNA提取試劑盒［天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)］進(jìn)行提取，提取方法以試劑盒操作說明書的步驟為主并略加改動(dòng)，將操作說明書中第4步的GP2替換為預(yù)冷的異丙醇（0.7倍體積），采用 Nano Drop 1000（Thermo Scientific）微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度，將最終濃度稀釋到100 ng·μL-1左右。

1.2.4 dCaps反應(yīng) 采用2×TaqMaster Mix（北京百泰客生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為 25μL，包括 2×Taq Master Mix 12.5μL，模板DNA 2.0μL，10 mol·L-1，上、下游混合引物 2μL，ddH2O 8.5μL；擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 30 s，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存。

dCaps引物為國(guó)內(nèi)公開發(fā)表的抗枯萎病生理小種1緊密連鎖的dCaps標(biāo)記502124_fon[16]，該標(biāo)記引物信息為：

上游引物序列為5′-AACACCACCCACTTTGGAGCTTCG-3′，下游引物序列為 5′-TTTTAGGGT GAAAATGGGTATTGTA-3′，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

dCaps產(chǎn)物采用內(nèi)切酶TaqI進(jìn)行酶切，酶切識(shí)別位點(diǎn)為 T’CGA，酶切體系為：10×Buffer 1.5μL，限制內(nèi)切酶 1.0μL；dCaps 擴(kuò)增產(chǎn)物 5.0μL，ddH2O 7.5μL，總體系為 15.0μL。酶切程序?yàn)椋?5 ℃條件下酶切16 h，80℃條件變性20 min，4℃保存，限制性內(nèi)切酶購自Fermentas公司。

2 結(jié)果與分析

全部混合樣品的DNA經(jīng)dCaps擴(kuò)增后均電泳出116 bp的條帶，該條帶被酶切后能夠產(chǎn)生94 bp的條帶，即“純株”抗病條帶，如經(jīng)酶切后仍電泳出116 bp條帶，即“雜株”感病帶，表明樣品中混入的雜株被成功檢測(cè)（圖1）。

2.1 不同比例葉片混合樣品

2.1.1不同比例新鮮真葉混合樣品 根據(jù)電泳結(jié)果，在總量為0.1g新鮮真葉混合樣品中，感病葉片量與混合葉片總量混合比例為1∶2時(shí)116 bp的感病條帶最為清晰，隨著混合樣品比例的降低，116 bp條帶逐漸模糊，但直到最低的1∶20混合樣品比例時(shí)仍可以分辨出116 bp條帶。

當(dāng)真葉混合總量提高到0.5g時(shí)，感病葉片量與混合葉片總量比例為1∶5和1∶10時(shí)，感病116 bp電泳條帶清晰可見，但當(dāng)混合比例降低到1∶20時(shí)116 bp感病條帶消失，即無法進(jìn)行雜株位點(diǎn)鑒定。

圖1 不同比例葉片混樣的dCaps電泳結(jié)果

2.1.2 不同比例干燥真葉混合樣品 在總量為0.01g干燥真葉混合樣品中，感病葉片量與混合葉片總量比例為 1∶2、1∶5 和 1∶10 時(shí) 116 bp 條帶清晰可見，當(dāng)混合樣品比例降低到1∶20時(shí)仍可以分辨出116 bp條帶。

當(dāng)干燥真葉混合總量提高到0.1g時(shí)，在1∶5和1∶10比例的混合樣品中，116 bp電泳條帶清晰可見，當(dāng)混合樣品比例降低到1∶20則變?yōu)槿鯒l帶，但是當(dāng)混合樣品比例降低到1∶100時(shí)，感病條帶116 bp仍有模糊的痕跡。

2.2 不同比例DNA混合樣品

提取的DNA經(jīng)過不同比例混合后進(jìn)行了dCaps反應(yīng)，在1∶5和1∶10比例的混合樣品中電泳出了清晰的116 bp條帶，當(dāng)混合樣品比例降低到1∶20時(shí)變?yōu)槿鯉В钡交旌蠘悠繁壤档偷?∶50時(shí)弱帶仍然存在，混合樣品比例降低到1∶100時(shí)弱帶才完全消失。

2.3 不同類型混合樣品結(jié)果的比較

對(duì)干燥真葉混合樣品結(jié)果與新鮮真葉混合樣品結(jié)果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，干燥真葉混合樣品后雜株位點(diǎn)可檢測(cè)的混合樣品比例更低，如干燥真葉雜株混合樣品比例為1∶20時(shí)雜株位點(diǎn)仍然可以識(shí)別，并且在1∶50仍有檢測(cè)條帶的痕跡，而新鮮真葉雜株混合樣品比例為1∶20時(shí)雜株位點(diǎn)條帶消失或模糊。

新鮮真葉經(jīng)過DNA提取混合樣品后，在1∶50時(shí)仍有可檢測(cè)條帶的痕跡，與干燥真葉混合樣品效果類似，表明新鮮真葉經(jīng)過干燥或DNA提取后再混合樣品可以提高雜株檢測(cè)靈敏度。

綜合以上不同混合樣品電泳結(jié)果分析，推薦雜株位點(diǎn)檢測(cè)最低混合樣品比例為1∶10，即10株可以為西瓜純度分子鑒定的可靠混合株數(shù)。

3 討論與結(jié)論

利用分子標(biāo)記技術(shù)可以從DNA遺傳角度對(duì)西瓜純度進(jìn)行分析和鑒定，能夠最大程度地排除環(huán)境因素對(duì)鑒定結(jié)果的影響，相較于傳統(tǒng)的田間表型性狀觀察鑒定具有明顯優(yōu)勢(shì)，并且分子標(biāo)記的技術(shù)特點(diǎn)具備了混合樣品分析的可能，通過合理混合樣品可以避免逐株進(jìn)行分析，能夠減少鑒定工作量、提高鑒定效率。筆者通過不同質(zhì)量的新鮮真葉混合、干燥真葉混合以及提取的DNA樣品混合，表明不同的樣品混合可鑒別的最低比例不太相同，最低的鑒定比例為1∶50，即最大混合株數(shù)為50株，在該混合樣品中只要存在1株雜株就可以識(shí)別出雜株的分子標(biāo)記位點(diǎn)，一般的混合比例為1∶10，即混合株數(shù)為10株。綜合鑒定的穩(wěn)定性和可靠性，推薦混合株數(shù)為10株，這個(gè)混合樣品數(shù)量與大豆混合樣品研究結(jié)果相似[16]，可作為實(shí)際混合樣品鑒定的參考混合株數(shù)，能夠?qū)㈣b定工作量縮短10倍左右。

不同樣品類型混合后鑒定的靈敏度不太一致，本試驗(yàn)結(jié)果表明，干燥真葉混合比新鮮真葉混合效果好，而提取后的DNA混合比干燥真葉混合效果好，出現(xiàn)這種情況可能與混合樣品的均勻性有關(guān)，關(guān)于混合樣品方式的優(yōu)化有待進(jìn)一步比較和研究。