胡建春,侯　佳,李月婷,3,鞏仔鵬,3，蘭燕宇,3，王永林,3，王愛民

(貴州醫(yī)科大學1.貴州省藥物制劑重點實驗室，2.民族藥與中藥開發(fā)應用教育部工程研究中心，3.藥學院，4.國家苗藥工程技術研究中心，貴州 貴陽　550004)

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赤芍提取物中兩種主要成分在Caco-2細胞中的攝取特性研究

胡建春1，3，4,侯佳1,李月婷1,3,鞏仔鵬1,3，蘭燕宇1,3，王永林1,3，王愛民2,3

(貴州醫(yī)科大學1.貴州省藥物制劑重點實驗室，2.民族藥與中藥開發(fā)應用教育部工程研究中心，3.藥學院，4.國家苗藥工程技術研究中心，貴州 貴陽550004)

赤芍；攝??；Caco-2細胞模型；超高效液相-雙重四極桿質譜；芍藥苷；苯甲酰芍藥苷

赤芍為毛莫科植物川赤芍PaeoninveitchiiLynch的干燥根，具有清熱涼血、散癖止痛等功效。現(xiàn)代藥理研究表明，赤芍具有擴張血管、解熱解痙、抗血栓形成等藥理作用。芍藥苷是芍藥總苷的主要成分[1]，具有赤芍上述的藥理功效，但研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷的胃腸吸收很差，生物利用度低[2]，限制了其臨床應用。本研究利用 Caco-2 細胞模型[3-4]對赤芍主要成分芍藥苷、苯甲酰芍藥苷進行體外吸收特性的初步研究，旨在為赤芍的進一步開發(fā)提供理論依據(jù)。

1　材料

1.1儀器與試藥超高液相色譜色譜-三重四級桿質譜聯(lián)用儀(美國Waters公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo scientific)；超凈工作臺(蘇州凈化設備總廠)；illicell-ERS電位儀(美國Millipore公司)；功能酶標儀(Thermo3001 VARIOSKAN FLASH)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus)。

苯甲酰芍藥苷(批號：20120315)、芍藥苷(批號：S12-100819)、葛根素(批號：110752-200912)；赤芍提取物，自制(批號：20120615)；Hank’s緩沖溶液(HBSS, Gibco)；胰蛋白酶(trypsin，Sigma)；考馬斯亮藍(批號：20130523，南京建成生物工程研究所)。

1.2細胞株Caco-2細胞株(上海中科院)，實驗用的細胞傳代數(shù)在50代以內。

2　方法

2.1色譜條件Waters Acquity BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；柱溫：45℃，0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脫，梯度為0～2 min: 5%～25%，2～3 min：25%～95%，4 min:5%；流速為0.35 mL·min-1；進樣體積為1 μL。

2.2質譜條件電噴霧電離源(ESI)；離子源溫度：120 ℃；毛細管電壓：3 kV；去溶劑氣溫度：350 ℃；碰撞氣為Ar(0.16 mL·min-1)；去溶劑氣為N2(650 L·h-1)；掃描方式為多反應離子監(jiān)測模式(MRM)。苯甲酰芍藥苷：m/z 583.3、芍藥苷：m/z 525.2及葛根素：m/z 417.0。

2.3樣品處理參照文獻[2]，取250 μL細胞懸液加入400 μL乙腈沉淀蛋白，渦旋2 min，15 000 r·min-1離心10 min，取上清液1 μL進樣分析；另取10 μL細胞懸液以考馬斯亮藍法測定蛋白含量。攝取量以 mg(藥物)·g-1(蛋白)表示。

2.4細胞的毒性研究(MTT法)參照文獻[5]，進行Caco-2細胞的培養(yǎng)及細胞毒性試驗。正常對照組每孔加入100 μL DMEM培養(yǎng)液；考察組分別加入100 μL不同濃度的空白溶劑DMSO(2.5、5、10、20、30)、HBSS緩沖溶液(pH 4、6、7.4)、不同濃度的赤芍提取物(0.1、1、5、15、30 mg·L-1)及P-gp抑制劑維拉帕米(25、50、100、200、400 mg·L-1)和環(huán)孢菌素A(5、25、50、100、200 mg·L-1)，考察受試物的細胞毒性。

2.5赤芍提取物的細胞攝取特性研究參照文獻[6-7]進行Caco-2細胞的培養(yǎng)及細胞攝取影響因素考察實驗，分別考察培養(yǎng)時間(15、30、60、90、120、180 min )、不同赤芍提取物濃度(0.2、1、2.5、5、7.5 g·L-1)、培養(yǎng)介質不同pH(4.0、6.0、7.4)、P-糖蛋白抑制劑(維拉帕米、頭孢菌素A)及不同溫度(4 ℃、25 ℃、37 ℃)對赤芍提取物中兩種有效成分在Caco-2細胞中攝取的影響。

3　結果

3.1Caco-2細胞毒性研究實驗結果表明，在實驗范圍內各受試物對Caco-2細胞生長無不良影響。

3.2濃度依賴性攝取實驗在0.6～7.5 g·L-1內芍藥苷和苯甲酰芍藥苷的細胞攝取量與濃度呈線性關系，回歸方程分別為為Y=0.1267X-0.1556，r2=0.9745；Y=0.0285X-0.0622，r2=0.8978；表明芍藥苷和苯甲酰芍藥苷的攝取主要表現(xiàn)為被動擴散，見Tab 1。

Tab 1　Concentration-dependent effect of extracts on uptake in Caco-2 monolayer

3.3不同時間對Caco-2細胞攝取的影響在不同的攝取時間下，芍藥苷和苯甲酰芍藥苷的細胞攝取量都隨著時間的增加而增加。

3.4pH值對Caco-2細胞攝取的影響在pH 4.0、6.0、7.4條件下，芍藥苷和苯甲酰芍藥苷的細胞攝取量隨pH增加而降低。其中苯甲酰芍藥苷在pH 7.4條件下藥物的細胞攝取量明顯低于pH 6.0(P<0.05)，表明堿性環(huán)境相對不利芍藥苷和苯甲酰芍藥苷的吸收，見Tab 2。

Tab 2　pH-dependent effect of extracts on intake in Caco-2 monolayer

*P<0.05vspH 6

3.5不同溫度對Caco-2細胞攝取的影響芍藥苷和苯甲酰芍藥苷的細胞攝取量都隨著溫度的增加而增加，且苯甲酰芍藥苷的攝取隨溫度(4 ℃與37 ℃)增加，差異有顯著性(P<0.05)，見Tab 3。

3.6抑制劑對Caco-2細胞攝取的影響采用SPSS 18.0軟件，經(jīng)單因素方差分析，結果顯示抑制劑對芍藥苷及苯甲酰芍藥苷的細胞攝取無明顯影響。

Tab 3　Temperature-dependent effect of extracts on intake in Caco-2 monolayer

*P<0.05vs4 ℃

4　討論

本實驗研究標明，在0.2～7.5 g·L-1范圍內，芍藥苷、苯甲酰芍藥苷的細胞攝取表現(xiàn)出一級速率過程的特征，表明赤芍提取物的攝取機制可能為被動擴散。藥物攝取受時間、濃度、pH的影響。在中性、偏堿性條件下，藥物的攝取明顯降低，可能是由于中性、偏堿性條件下二者分子中的酯基水解，導致膜滲透性降低。環(huán)孢菌素A和維拉帕米對二者在Caco-2細胞中的攝取量沒有明顯增加作用，提示芍藥苷和苯甲酰芍藥苷可能不是P-gp底物。

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Uptake characteristics of two components fromPaeoniaLactifloraPall.in Caco-2 cell monolayer model

HU Jian-chun1，3，4, HOU Jia1, LI Yue-ting1,3, GONG Zi-peng1,3, LAN-Yanyu1,3, WANG Yong-lin1,3, WANG Ai-ming2,3

(1.GuizhouProvincialKeyLaboratoryofPharmaceutics,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China; 2.EngineeringResearchCenterfortheDevelopmentandApplicationofEthnicMedicineandTCM(MinistryofEducation),GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China；3.CollegeofPharmacy,GuizhouMedicalUniversity,4.NationalEngineeringResearchCenterofMiaoMedicine,Guiyang550004,China)

PaeoninLactiflora; uptake characteristics;Caco-2 cell monolayer model; HPLC-MS/MS; paeoniflorin; benzoylpaeoniflorin

2016-02-15，

2016-05-09

國家自然科學基金資助項目(No 81260636); 貴州省科學技術基金(No 黔科合J字[2013]2035號);貴州省中藥現(xiàn)代化專項項目(No 黔科合重G字[2013]4001) ;貴州省中醫(yī)藥管理局項目(No QZZY-2015-080)；貴州省優(yōu)秀青年科技人才培養(yǎng)對象專項資金(No 黔科合人字[2015]11號)

胡建春(1989-)，女，碩士生，研究方向：藥物新劑型、新技術、新工藝研究與新藥研發(fā)， Tel: 0851-6908468, E-mail:jianchun89@163.com；

王永林(1954- )，男，教授，博士生導師，研究方向：中藥藥效物質基礎與藥物代謝動力學，通訊作者,Tel：0851-6908899，E-mail：gywyl@gmc.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.09.029

A

1001-1978(2016)09-1329-03

R-282.71;R284.1;R322.45;R329.24

網(wǎng)絡出版時間：2016-8-23 14:29:00網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160823.1429.058.html