張瑞瑞，馮麗萍，雍志強，康開彪，潘　文*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學, 甘肅 蘭州　73000；2.甘肅中醫(yī)藥研究院，甘肅 蘭州　730050 )

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補腎化瘀方對PCOS模型大鼠中TNF-α表達的影響

張瑞瑞1，馮麗萍1，雍志強1，康開彪2，潘文2*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學, 甘肅 蘭州73000；2.甘肅中醫(yī)藥研究院，甘肅 蘭州730050 )

多囊卵巢綜合征;腫瘤壞死因子α;補腎化瘀方;免疫印跡;肝臟;卵巢;脂肪

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是一種常見的疾病，估計影響5.6%生殖期中國女性[1]。目前現(xiàn)代醫(yī)學治療PCOS多采用生活方式干預(yù)和藥物治療，存在不良反應(yīng)及用藥后易復發(fā)的弊端[2]，隨著中醫(yī)對 PCOS 研究的不斷深入，認識到腎虛血瘀是PCOS的基本病機[3]。補腎化瘀方為甘肅省中醫(yī)院婦科經(jīng)驗方。臨床觀察表明補腎化瘀方對多囊卵巢綜合征病例有顯著療效。通過動物實驗研究促炎因子TNF-α變化來闡述補腎化瘀方對多囊卵巢綜合征的作用機制。

1　材料

1.1實驗動物6周齡SD ♀大鼠120只(體質(zhì)量180 g±20 g)由甘肅中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，批號：SYXK(甘)2011-0001-62001000000039，SPF級。

1.2主要試劑補腎化瘀方由甘肅省中醫(yī)院藥劑室制成水煎劑，4℃保存?zhèn)溆?。二甲雙胍片(H20080697)；TNF-α抗體(ab6671)。依據(jù)人與大鼠之間用藥劑量換算，將補腎化瘀方配成等容量溶液，中藥含量分別為1.98 g·mL-1(高劑量)、0.989 g·mL-1(中劑量)、0.495 g·mL-1(低劑量)，二甲雙胍組4.498 g·L-1。

1.3PCOS大鼠模型制備和取材120只大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組，模型組，對照組，中藥低、中、高劑量組6組，各20只，按參考文獻[4]以來曲唑法連續(xù)灌胃24 d制作模型，并進行模型鑒定。鑒定成功后按照等容量灌胃，正常組和模型組予生理鹽水1 mL·kg-1·d-1灌胃，對照組予4.498 mg·kg-1·d-1二甲雙胍灌胃，補腎化瘀方予高劑量1.98 g·kg-1·d-1、中劑量0.989 g·kg-1·d-1、低劑量0.495 g·kg-1·d-1灌胃，持續(xù)14 d。大鼠于80 d齡左右，行腹主動脈取血后脫臼處死，取大鼠卵巢、肝臟、脂肪，置于液氮中2 h后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。

2　方法

2.1Western blot檢測大鼠肝臟、卵巢、脂肪蛋白表達TNF-α蛋白在肝臟、卵巢、脂肪表達的檢測采用Western blot方法，取各組肝臟、卵巢、脂肪組織各100 mg用組織裂解液裂解并勻漿，4℃離心0.5 h，上清液作標本。電泳分離、封閉、結(jié)合一抗(1 ∶1 000)，洗滌、結(jié)合稀釋好的二抗(抗兔 Ig G)孵育，洗膜后用ECL顯像曝光，應(yīng)用光密度掃描儀測各條帶密度，同時以β-肌動蛋白(β-actin)作為內(nèi)參照。

3　結(jié)果

模型組肝臟、卵巢、脂肪組織中TNF-α蛋白表達明顯高于正常組(均P<0.01)。與模型組相比，對照組和中藥各劑量組肝臟、卵巢、脂肪組織中TNF-α蛋白表達明顯降低(均P<0.01)。中藥各劑量組肝臟、卵巢、脂肪組織中TNF-α蛋白表達相比較，中藥中劑量組為最優(yōu)劑量，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，中藥中劑量組優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見Tab 1。

Tab 1　Comparison of tissue TNF-α levels in liver, ovary and adipose in ±s,n=3)

pcos：**P<0.01vsnormal；△△P<0.01vsmodel；#P<0.05vscontrol；▲P<0.05vsBushen huayu lower dose；□P<0.05vsBushen huayu middle dose

4　討論

國內(nèi)外學者提出了許多相關(guān)機制學說，其中炎癥學說是當今國內(nèi)外的一個研究熱點。TNF-α影響卵泡發(fā)育和類固醇生成[5]，近年來有學者[6]提出PCOS是一種慢性炎癥性疾病，Mattyasovszky等[7]研究發(fā)現(xiàn)PCOS經(jīng)常遭受慢性炎癥的特別是促炎細胞因子TNF-α影響，且TNF-α影響卵泡生長、排卵和黃體衰退。通過Thathapudi等[8]實驗發(fā)現(xiàn)，PCOS患者與健康組相比，血清中TNF-α、雄激素明顯升高，表明TNF-α可能是導致PCOS的發(fā)病原因，目前臨床治療 PCOS 多采用生活方式干預(yù)輔以西藥藥物治療[9]，存在諸多不良反應(yīng)和用藥后易復發(fā)的弊端。

本實驗結(jié)果示：TNF-α和PCOS形成關(guān)系密切，同時補腎化瘀方能降低組織中炎癥因子TNF-α，減緩PCOS的形成。補腎化瘀方組療效與二甲雙胍對照組療效進行對比，補腎化瘀方有效降低TNF-α表達水平。補腎化瘀方通過抑制TNF-α治療PCOS，這可能是其有效防治PCOS的機制之一。但是，由于小樣本分析，此結(jié)果仍需在后續(xù)實驗中得到驗證?？傮w而言，促炎癥因子TNF-α升高能夠形成PCOS，而補腎化瘀方通過益腎精，化瘀滯，降低TNF-α水平，進而證明其能起到預(yù)防和治療多囊卵巢綜合征的作用，為預(yù)防和治療多囊卵巢綜合征提供一種新選擇。

(致謝：本實驗在甘肅中醫(yī)藥大學分子實驗室完成，在此深表感謝！)

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Effects of Bushen huayu recipe on TNF-α expression in PCOS rat model

ZHANG Rui-rui1,FENG Li-ping1,YONG Zhi-qiang1,KANG Kai-biao2,PAN Wen2

(1.GansuUniversityofTraditionalChineseMedicine,Lanzhou730000,China;2.GansuProvincialInstituteofTCM,Lanzhou730050,China)

PCOS;TNF-α;Bushen huayu recipe;Western blot;liver;ovary;adipose

2016-04-07，

2016-05-03

國家自然科學基金項目(No 81360604)；甘肅省教育廳碩士生導師項目(No 1206-07)；甘肅省技術(shù)研究與開發(fā)專項計劃項目(No 1305TCYA029)；甘肅省衛(wèi)生行業(yè)科研計劃管理項目(No GWGL2013-3)

張瑞瑞(1989-)，女，碩士生，研究方向：婦科血瘀證的實驗研究，E-mail：zhangruirui_vip@163.com；

潘文(1963-)，女，教授，碩士生導師，研究方向：不孕癥的中西醫(yī)結(jié)合治療，通訊作者，E-mail：panwen25@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.09.030

A

1001-1978(2016)09-1331-02

R-332； R256.5；R289.5 ；R711.75；R977.6

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-8-23 14:29:00網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160823.1429.060.html