王衍海　顧金保

100052 北京， 中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(王衍海)；510515 廣州， 南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院(顧金保)

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·論著·

白紋伊蚊內(nèi)源性登革病毒序列分析

王衍海顧金保

100052 北京， 中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(王衍海)；510515 廣州， 南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院(顧金保)

目的分析和驗(yàn)證白紋伊蚊(佛山株)基因組中的登革病毒來源的內(nèi)源性病毒序列(endogenous viral elements，EVEs)。方法使用Blast序列比對工具，分別以四型登革病毒基因組全序列為待查序列對白紋伊蚊基因組進(jìn)行序列比對分析。根據(jù)篩選得到的EVEs序列設(shè)計(jì)基因特異性引物，分別以雌、雄各8只成蚊個體進(jìn)行基因組PCR檢測并測序驗(yàn)證。結(jié)果在白紋伊蚊基因組上共計(jì)找到5個與登革病毒高度同源性的EVEs片段。其中，EVE-1與DENV-2 P8-1407MS株、EVE-2-5與DENV-1 02-20株具有高度的相似性?；蚪MPCR檢測結(jié)果顯示，EVE-1在種群個體中保守存在，而EVE-2未檢測到，EVE-3-5在不同個體中變異度較高。結(jié)論白紋伊蚊基因組中存在登革病毒序列來源的EVEs，為研究登革病毒與媒介之間的相互作用提供了新的方向。

【主題詞】登革熱病毒；伊蚊屬；內(nèi)源性病毒序列

Fundprograms:NationalNaturalScienceFoundationofChina(81371846);PearlRiverS&TNovaProgrammeofGuangzhou(2014J2200032)

多種病毒在宿主細(xì)胞繁殖的長期過程中可以通過不同方式將部分或全部遺傳物質(zhì)整合入宿主基因組中，并隨之遺傳至子代，這種現(xiàn)象被稱為病毒內(nèi)生化(endogenization)，其整合入的序列稱為內(nèi)源性病毒序列(endogenousviralelements，EVEs)[1]。在研究真核細(xì)胞基因組的過程中，人們發(fā)現(xiàn)除逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)在其復(fù)制周期中具有整合入基因組而內(nèi)生化的現(xiàn)象外， 一些DNA病毒和非反轉(zhuǎn)錄、RNA病毒亦存在整合入宿主細(xì)胞基因組的序列，這些來源不同的EVEs分別稱之為內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(endogenousRetrovirus，ERV)、內(nèi)源性DNA病毒與非逆轉(zhuǎn)錄整合RNA病毒(non-retroviralIntegratedRNAVirus，NIRV)[2,3]。白紋伊蚊是我國最重要的登革病毒(Denguevirus，DENV)媒介，本研究中，我們將分析、驗(yàn)證白紋伊蚊基因組中存在的登革病毒來源的EVEs。

1　材料與方法

1.1蚊株與飼養(yǎng)白紋伊蚊為我室保種廣東佛山株。成蚊的飼養(yǎng)溫度為27℃-29℃，濕度70%-80%，光照射循環(huán)12h/d，喂飼10%葡萄糖水。幼蟲飼養(yǎng)于脫氯自來水，水溫27℃-29℃，喂飼魚食、酵母片1∶1混合物。

表1　白紋伊蚊 DENV來源的EVEs

1.2數(shù)據(jù)分析流程使用本地比對工具Blast 2.3.0，分別以4型登革病毒基因組全序列為待查序列。登革1型病毒(Dengue Type 1 virus， DENV-1)Singapore 8114/93株(GenBank No.AY762084)與WestPac(GenBank No.U88535)；DENV-2 I348600株(GenBank No.AY702040)與ThD2_0017_98株(GenBank No.DQ181799)；DENV-3 KJ71株(GenBank No.AY858044)與TB16株(GenBank No. AY858047)；DENV-4 Singapore 8976/95株(GenBank No.AY762085)與ThD4_0476_97株(GenBank No.AY618988)與白紋伊蚊佛山株基因組(GenBank No.GCA_001444175)進(jìn)行BlastN同源性比對。

1.3PCR檢測與測序分別采集白紋伊蚊羽化后1 d雌、雄成蚊各8只樣品，使用Insect DNA Kit昆蟲組織DNA小量提取試劑(美國Omega Biotek公司)提取各樣品總DNA。使用EmeraldAmp MAX PCR 預(yù)混試劑盒(大連 TaKaRa 公司)，以各個樣品基因組DNA為模版，根據(jù)各登革病源EVEs序列自行設(shè)計(jì)基因特異性引物行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：基因組DNA 100 ng，上下游引物各20 pmol，EmeraldAmp MAX PCR Master Mix(2×Premix)25 μl，加去離子水至總體積50 μl。引物序列為，EVE-1F：5′-GGTGTACGAAACACCTACAGTG-3′，EVE-1R：5′-AGCTTGGGACAAGCGTAGAA-3′； EVE-2F： 5′-AACCAGTCAACATTGAGGCA-3′， EVE-2R：5′-GGTCTTCGTTCATGAAACCA-3′；EVE-3F： 5′-CCTCACTAAAGGGAGTTGT-3′，EVE-3R： 5′-TGTTCTTGTCGGTCCACGTA-3′；EVE-5F： 5′-CCAATCCCAATGGCGACCT-3′，EVE-5R： 5′-AATACGTCTTTCCCGGAGT-3′。白紋伊蚊核糖體蛋白基因Rps-7為內(nèi)參照[4]，PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。陽性條帶經(jīng)凝瓊脂糖凝膠回收試劑盒(北京 Tiangen公司)純化后使用Mighty TA-cloning Kit(大連 TaKaRa 公司)亞克隆入pMD20-T載體后送華大基因進(jìn)行測序分析。

2　結(jié)果

2.1登革病毒來源EVEs的比對以Blast N比對結(jié)果E-value<1e-10且Score>100為有意義，在白紋伊蚊佛山株基因組上共計(jì)找到5個與登革病毒高度同源性的EVEs片段(表1)，其中EVE-1與DENV-2 P8-1407MS株序列相似度達(dá)到100%，該病毒株在1970年分離于馬來西亞的猴類體內(nèi),與我國河南省新近分離的DENV-1核酸序列相似性也達(dá)到99%[5]。其他4處片段(EVE-2-5)，與DENV-1 02-20株的序列相似度均達(dá)到99.7%以上。其中在基因組Scaffolds JXUM01S011899，從起始位置7 278到終止18 218，觀察到了幾乎完整的DENV-1(全長10 719 nt)的序列，包括編碼區(qū)與非編碼區(qū)。為了研究這些EVEs是否有轉(zhuǎn)錄，通過在線比對工具(www.vectorbase.org/blast)將它們與白紋伊蚊轉(zhuǎn)錄組又進(jìn)行了相應(yīng)的同源性比對與白紋伊蚊佛山株的轉(zhuǎn)錄組比對，結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)比對有意義的轉(zhuǎn)錄組。

2.2基因組PCR為了驗(yàn)證這些EVEs是否存在于白紋伊蚊基因組，我們設(shè)計(jì)了基因特異性引物進(jìn)行基因組PCR驗(yàn)證，設(shè)計(jì)原則為，上下游引物中一個引物位于病毒序列，一個引物位于病毒序列之外的接臨基因組中，引物位置見圖1A。由于EVE-3、EVE-4與EVE-5在基因組中位置相連，我們只設(shè)計(jì)了針對EVE-3和EVE-5相應(yīng)的引物。為了驗(yàn)證這些EVEs序列是否普遍存在于種群中，還是存在個體差異，我們隨機(jī)選取了非同一母系的子代個體雌雄各8只進(jìn)行了RCR驗(yàn)證。結(jié)果證實(shí)，EVE-1在所有雌雄8個個體中均得到了陽性反應(yīng)(圖1B)，產(chǎn)物回收后亞克隆入pMD20-T載體，經(jīng)序列測定與預(yù)期結(jié)果一致。但是，對于EVE-2在所有雌雄8個個體中均未獲得預(yù)期陽性條帶(圖1B)。EVE-3和EVE-5在蚊蟲種群中分布有個體差異性，在部分個體中出現(xiàn)陽性條帶(圖1B)，測序結(jié)果與預(yù)期序列一致。

A:引物所在基因組位置；B: EVEs候選序列基因組PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖1　白紋伊蚊EVEs候選序列基因組PCRA: Location of primers in the Ae.albopictus genome; B: Agarose gel electrophoresis of PCR products of the EVEs candidatesFig.1　Analysis of EVEs in Ae.albopictus genome with genomic DNA PCR

3　討論

白紋伊蚊不僅是一種攻擊性很強(qiáng)的吸血蚊種，也是一種重要的傳染病媒介，可作為20多種人類致病病毒的媒介，包括登革病毒、基孔肯雅病毒、黃熱病毒、羅斯河病毒和西尼羅病毒等，也有作為寨卡病毒的媒介的潛在能力[6,7]。白紋伊蚊基因組大小約1 967 Mb，擁有目前基因組已知蚊種中最大的基因組，大約68%為重復(fù)序列組成[8]，而真核生物的一些重復(fù)序列與EVEs有關(guān)，可能由于病毒與宿主的相互作用過程中整合入宿主的基因組形成。目前真核生物基因組中大多數(shù)EVEs位于非編碼區(qū)，少部分可轉(zhuǎn)錄編碼功能蛋白。EVEs的功能目前認(rèn)為主要參與了宿主與病毒之間的免疫進(jìn)程，對于非編碼的EVEs，目前發(fā)現(xiàn)有些可能表達(dá)一些小RNA分子，例如piRNAs，從而參與與免疫相關(guān)的基因調(diào)控中[9,10]。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)了白紋伊蚊基因組內(nèi)存在登革病毒來源的EVEs，并通過相應(yīng)的PCR方法證實(shí)了這些EVES并非來自基因組測序污染。但是結(jié)果也顯示有些EVEs在種群內(nèi)具有明顯的個體差異性分布，這可能與這些EVEs在種群中的變異程度較高有關(guān)。這些EVEs是否通過某些途徑參與登革病毒與媒介之間的相互作用有待我們進(jìn)一步研究。

[1]Mager DL, Stoye JP. Mammalian Endogenous Retroviruses[J]. Microbiol Spectr, 2015, 3(1):MDNA3-0009-2014. doi:10.1128/microbiolspec.MDNA3-0009-2014.

[2]Ballinger MJ, Bruenn JA, Taylor DJ. Phylogeny, integration and expression of sigma virus-like genes in Drosophila[J]. Mol Phylogenet Evol, 2012,65(1):251-258. doi: 10.1016/j.ympev.2012.06.008.

[3]Chabannes M, Iskra-Caruana ML. Endogenous pararetroviruses-a reservoir of virus infection in plants[J]. Curr Opin Virol, 2013,3(6):615-620. doi: 10.1016/j.coviro.2013.08.012.

[4]Liu P, Li X, Gu J, et al. Development of non-defective recombinant densovirus vectors for microRNA delivery in the invasive vector mosquito, Aedes albopictus[J]. Sci Rep, 2016, 6:20979. doi: 10.1038/srep20979.

[5]杜燕華, 張白帆, 李懿, 等.河南省登革熱1型病毒的發(fā)現(xiàn)與全基因組序列分析[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2015,49(10):892-895. doi：10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2015.10.011.

[6]Ngoagouni C, Kamgang B, Nakouné E, et al. Invasion of Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) into central Africa: what consequences for emerging diseases [J]? Parasit Vectors, 2015,8:191. doi: 10.1186/s13071-015-0808-3.

[7]Chouin-Carneiro T, Vega-Rua A, Vazeille M. Differential Susceptibilities of Aedes aegypti and Aedes albopictus from the Americas to Zika Virus[J]. PLoS Negl Trop Dis, 2016,10(3):e0004543. doi:10.1371/journal.pntd.0004543.

[8]Chen XG, Jiang X, Gu J, et al. Genome sequence of the Asian Tiger mosquito, Aedes albopictus, reveals insights into its biology, genetics, and evolution[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2015,112(44):E5907-5915. doi: 10.1073/pnas.1516410112.[9]Feschotte C, Gilbert C. Endogenous viruses: insights into viral evolution and impact on host biology[J]. Nat Rev Genet, 2012,13(4):283-296. doi: 10.1038/nrg3199.

[10]賴植發(fā), 王衍海, 顧金保, 等. 白紋伊蚊感染登革病毒后病毒特異性piRNAs分析[J]. 中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志,2014,28(4): 277-279. doi: 10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2014.04.012.

Analysis of endogenous viral elements derived from dengue virus inAedesalbopictusgenome

WangYanhai，GuJinbao

StateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasesControlandPrevention,NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing100052,China(WangYH);SchoolofPublicHealth,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China(GuJB)

Gujinbao，Email：gujinbao@fmmu.corn

ObjectiveToidentifyandanalyzedenguevirus-derivedendogenousviralelements(EVEs)inAedes albopictus (Foshanstrain)．MethodsThefullsequencesoffourserotypesofdenguevirus(DENV1-4)wereusedasqueries,andBlastNprogramwasusedtoscanthegenomeofAe.albopictus．ThecandidatesofEVEswereconfirmedbyPCRmethodusingspecificprimerswithgenomicDNAastemplatefrom8individualsoffemaleandmaleadult,respectivly.ResultsTotal5EVEscandidatesdisplayedthehighgeneticsimilaritywithDENVgenomesequences.Amongthem,EVE-1showed100%geneticsimilaritywithDENV-2P8-1407MSstrain，whereasEVE-2-5showedmorethan99%geneticsimilaritywithDENV-1 02-20strain.GenomicDNAPCRresultsindicatedthatEVE-1exhibitsequenceconservationacrossindividualsamongpopulation,whereastheEVE-3-5displayedthegenomicsequencevariationinindividuals.ConclusionsDenguevirus-derivedEVEswereindentifiedinAe.albopictus,thatmayprovidenewinsightintotheinteractionbetweenDENVandtheirvectors.

Denguevirus；Aedes；Endogenousviralelements

顧金保， Email:gujinbao@fimmu.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.04.001

國家自然科學(xué)基金(81371846)；珠江科技新星(2014J2200032)

2016-04-06))