紀培麗　姜芬芬　李穎　劉宏圖

102206 北京，中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所病毒相關腫瘤室(紀培麗、李穎、劉宏圖)；100073 北京電力醫(yī)院婦產科(姜芬芬)

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·論著·

北京地區(qū)人乳頭瘤病毒39型的人群分布特征

紀培麗姜芬芬李穎劉宏圖

102206 北京，中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所病毒相關腫瘤室(紀培麗、李穎、劉宏圖)；100073 北京電力醫(yī)院婦產科(姜芬芬)

目的研究北京地區(qū)人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)39型的感染情況及分布規(guī)律。方法收集2013年1月至2014年7月就診于中國人民解放軍總醫(yī)院婦產科，并在30天內同時進行宮頸脫落細胞HPV分型檢測及新柏氏薄層液基細胞學檢測的女性患者，回顧性收集其臨床信息。通過聚合酶鏈式反應對HPV39陽性樣本進行HPV39病毒基因組全長擴增。結果19 018例受試者中，HPV39陽性為518例，陽性率為2.72%，且在21-25歲組和46-50歲組呈現感染高峰，其陽性率分別為2.98%和2.44%。在宮頸病變中，HPV39在低度鱗狀上皮內病變中的陽性率最高，為18.52%。共擴增出5例HPV39陽性樣本的病毒全基因組。結論HPV39隨年齡增大呈雙峰分布，且在低度鱗狀上皮內病變中占有較高的比例。宿主細胞中存在附加體形式的HPV39。

【主題詞】乳頭狀瘤病毒，人；陽性率；基因

Fund programs: State Mega-project for Infectious Disease Research of China(2013ZX10004-101)

宮頸癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一。2012年世界范圍內新發(fā)病例約為527 600例，約有266 000人死于宮頸癌,占全部女性癌癥死亡人數的7.5%[1],其中，85%以上的死亡病例發(fā)生在發(fā)展中國家。中國國家癌癥中心發(fā)布的癌癥統(tǒng)計數據表明，2011年我國宮頸癌新發(fā)病例約8.8萬，且超過2萬女性死于宮頸癌[2]。

人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的持續(xù)感染是誘發(fā)宮頸癌最重要的因子[3]。在宮頸癌中，HPV的陽性率超過80%，有的地區(qū)甚至接近100%[4, 5]。根據致癌潛力的不同，HPV分為高危型、疑似高危型和低危型。高危型(high risk, HR)HPV與宮頸癌的發(fā)生密切相關。目前已經確認的高危型HPV有15種，HPV39是其中之一。HPV39在宮頸癌中的陽性率為1.3%[6]，有的地區(qū)甚至高達5.8%[7]。而且在癌前病變中，它在低級別鱗狀上皮內病變中的陽性率較高，為4.1%，占HPV陽性人群的8.90%[7]。

1　對象與方法

1.1研究對象收集2013年1月至2014年7月就診于中國人民解放軍總醫(yī)院婦產科，并在30 d內同時進行宮頸脫落細胞HPV分型檢測及新柏氏薄層液基細胞學檢測的女性受試者19 018例，年齡15-89歲，平均年齡41.00±10.96歲?；仡櫺允占颊叩南嚓P臨床信息。據細胞學檢測結果，其中上皮內病變或惡性病變陰性(negative for intraepithelial lesion or malignancy，NILM)17 790例，意義不明確的非典型鱗狀上皮細胞(atypical squamous cells of undetermined significance，ASC-US)959例，低度鱗狀上皮內病變(low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)93例，高度鱗狀上皮內病變(high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)176例。本研究經患者知情同意，并通過了中國疾病預防控制中心倫理委員會的批準。

1.2研究方法

1.2.1樣品HPV分型檢測:采用上海之江生物科技有限公司高危型人乳頭瘤病毒(HPV)分型核酸測定試劑盒(熒光PCR法)。該試劑可以針對HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68等13種HR-HPV分型檢測。操作步驟及結果判定嚴格按照其說明書進行。

1.2.2擴增病毒基因組的PCR引物及反應條件:HPV39病毒全基因組的擴增分三段進行，擴增片段大小分別為3 261 bp、3 486 bp和2 424 bp，分別稱之為目的片段X、Y和Z，片段X的上下游引物分別為5′-GGACCGCAGACTAACACGAA-3′和5′-ATGCCAGCGTTTTTGGTTCC-3′，包含完整的E7、E1和E4基因。片段Y的上下游引物分別為5′-GGGTGTGTGGACTATTGGGG-3′和5′-TCCTCCACGTGCCTGGTATA-3′，包含完整的E4、E5和L2基因。片段Z的上下游引物分別為5′-GGACTTTGGTGCATTGCAGG-3′和5′-GTCGCAGAGTATCCCGTGAG-3′，包含完整的L1和E6基因。上述擴增引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

使用Ex Taq(大連寶生物)以及廠商推薦條件擴增X、Y和Z 3個片段，使用Qiagen公司(德國)的QIAquick Gel Extraction Kit完成核酸回收。純化產物送北京擎科新業(yè)生物技術有限公司進行測序。

1.3數據分析用Excel 2010進行數據整理及作圖，用R進行統(tǒng)計分析，以P<0.05 判定為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1HPV39感染情況及比值比分析19 018例受試者中HR-HPV陽性共3 623例，陽性率為19.05%；其中HPV39陽性為518例，陽性率為2.72%。HPV39在HR-HPV中所占的比例為14.30%。在518例HPV39陽性樣本中，265例(51.16%)為HPV39單獨感染，253例(48.84%)為其他高危型別與HPV39的混合感染。除HPV39之外的其他12種HR-HPV均可與HPV39發(fā)生混合感染，其中以HPV68和HPV39的混合感染為最多，共92例(17.76%)，其次為HPV52(5.02%)、HPV58(4.25%)和HPV16(2.70%)。另外，以NILM為對照組，ASC-US、LSIL和HSIL三種宮頸損傷合并為病例組進行比值比(odds ratio，OR)計算，結果表明，HPV16、18、45、56和68等型別與HPV39混合感染的OR值以及三重感染的OR值均大于HPV39單獨感染，且P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義(表1)。

2.2HPV39在年齡組中的分布在NILM分組 (n=17 790)中，20歲以下的受試者數量僅為85，年齡段分析中沒有采用這部分數據。21-60歲之間每5歲作為一個年齡組，大于60歲的歸為一個年齡組，因該組涉及年齡跨度大，觀察HPV的年齡依存性分布時，60歲以上年齡組僅作為參考。從圖1可以看出，HPV39在21-25歲和46-50歲兩個年齡段具有較高的占比，分別為2.98%和2.44%，即總體分布呈雙峰型，且χ2=20.27，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學意義(其余年齡分組的占比數據見圖1)。HPV39單獨感染和混合感染的年齡分布亦呈現相同的規(guī)律，只是其高峰年齡略有差異，且不同年齡組間差異不顯著(圖1)。

2.3HPV39在宮頸病變中的分布在3 623例HPV陽性受試者中，HPV39在不同宮頸病變中的分布如圖2所示?？偟腍PV39陽性樣本在LSIL中有較高占比，為18.52%，高于其他三組，χ2=10.36，P<0.05。但是HPV39單獨感染在HPV陽性樣本中的陽性率及其在HPV單獨感染陽性樣本中的陽性率均是隨著宮頸病變的加重而逐漸降低。

表1　HPV39感染分布及比值比分析

注：a. 雙重感染共計12種，僅以非HPV39的型別表示；b.P<0.05；c.OR值的95%CI包含1.00；d. 由于該項病例組數據為零，所以無法計算OR值

Note:a. There were 12 dual infection，only non-HPV39 type showed；b.P<0.05；c. Ranges ofORs were cross 1.00；d. TheORvalue unavailable due to lack of abnormal samples

圖1　HPV39在不同年齡組中的陽性率Fig.1　Age-dependent prevalence of HPV39

圖2　HPV39在不同宮頸病變中的陽性率Fig.2　Cytology-dependent prevalence of HPV39

2.4HPV39基因組全長的擴增對5個HPV39陽性樣品，我們嘗試將病毒基因組分成三段進行PCR以擴增全長。PCR產物的電泳結果顯示：這些產物均呈現出單一的條帶，且亮度均一。和λE.coliT14 I digest Marker比較，片段X位于3 472 bp稍下面，片段Y位于3 472 bp稍上一點，而片段Z位于2 690 bp下面，因而這些PCR產物應該是預期的3 261 bp、3 486 bp和2 424 bp長度的PCR產物。雙邊測序確認了以上產物來源于HPV39樣本。

3　討論

HPV持續(xù)感染是誘發(fā)宮頸癌的必要因子之一，目前已經有超過200種HPV被鑒定出來，但是不同的HPV型別對宮頸上皮的致病性不同，其在不同的國家或地區(qū)的流行病學分布亦不相同。因而，了解各地區(qū)不同型別HPV的感染現狀以及分布規(guī)律對控制HPV感染、預防宮頸病變的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。

本研究對北京地區(qū)HPV39的感染現狀進行調查，結果顯示19 018例受試者中，HPV39陽性518例，陽性率為2.72%，在13種HR-HPV中的陽性率為14.30%，明顯高于云南的6.73%[8]。提示HPV39是北京地區(qū)女性感染的重要HPV型別之一，應在宮頸癌控制中提高重視。值得關注的是，HPV39陽性樣本中，48.84%為混合感染。從表1可以看到，只有HPV16、18、45、56、68與HPV39二重感染以及三重感染的危險性高于HPV39單獨感染，而HPV52、58與39的二重感染及四重感染并沒有表現出更高的危險性。這一現象與HPV52、58和39等型別在HR-HPV具有較低的致癌潛能一致[6]。

HPV感染屬于性傳播感染，因而HPV在年齡分布上非常不均衡。Dunne等[9]報道，美國女性初交后8-10年，即 20-24歲年齡段，HR-HPV感染率為44.8%，本研究觀察到HPV39在該年齡段的高分布特征與這個研究的HR-HPV總體分布規(guī)律具有較好的一致性。本研究發(fā)現的HPV39另一個感染高峰位于46-50歲組(圖1),這一人群的感染高峰可能是由于進入絕經期的女性，激素水平紊亂導致的病毒轉歸能力下降所致。

HPV是宮頸癌的必要致病因子，從疾病控制的角度看，探討病毒感染和癌前病變非常重要。本研究發(fā)現，隨著宮頸病變程度的加重，HPV39在NILM組和ASC-US組陽性率相近，至LSIL組達最高，之后又下降(圖2)。與Lurchachaiwong等[10]通過PCR檢測E1基因并通過測序分型所得結果類似。高危型HPV的某些基因整合到人基因組被認為是HPV誘發(fā)宮頸癌的關鍵因素。Vinokurova等[11]通過擴增病毒癌基因的轉錄產物的方法對部分HPV型別的整合狀態(tài)進行了研究，結果表明，HPV18、45、16、33和31的整合率分別是92%、83%、55%、37%和14%。HPV39的整合問題未見相關報道。本研究中，我們嘗試擴增病毒的全基因組，結果顯示，5例樣本中均存在HPV39的全基因組，提示環(huán)狀基因組的存在，說明HPV39在這些宿主細胞中存在附加體形式。本研究的后繼工作將會著重于整合體的研究。

本研究闡明了北京地區(qū)HPV39的感染情況及分布規(guī)律，并探討了HPV在感染細胞中的存在狀態(tài)，填補了國內HPV39研究的空白。在今后的研究中，我們將更深入的探討HPV39與宿主細胞的相互作用，進而闡明HPV39在宮頸病變中的作用及致病機制，從而為宮頸癌的防控和篩查提供參考。

致謝：感謝中國人民解放軍總醫(yī)院婦產科為本研究提供樣本。

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Distribution characteristics of human papillomavirus type 39 in Beijing

JiPeili，JiangFenfen，LiYing，LiuHongtu

DepartmentofVirusAssociatedTumors,NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention，ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention，Beijing102206，China(JiPL，LiY，LiuHT)；DepartmentofObstetricsandGynaecology，BeijingElecticPowerHospital，Beijing100073，China(JiangFF)

LiuHongtu，Email：liuht@chinacdc.cn

ObjectiveTo investigate the infection rate and distribution of human papillomavirus type 39 in Beijing.MethodsHPV genotyping detection coupled with cytological test of cervical exfoliated cells within 30 days were used for the patients from the People′s Liberation Army General Hospital, between January 2013 to July 2014. Full-length genomes were amplified for the HPV39 positive samples.ResultsAmong 19 018 samples, 518 were HPV39 positive (2.72%). Two peaks were observed in the age groups 21-25 and 46-50 years old, with positive rate of 2.98% and 2.44% respectively. The prevalence of HPV39 in low-grade squamous intraepithelial lesion (LSIL) was 18.52%, higher than other cervical lesion groups. In addition, full-length genome amplifications were successful in five HPV39 positive samples.ConclusionsIn the studied population, HPV39 showed two increases in age groups, and abundance in LSIL. Episomal form of HPV39 viral genomes existed in the samples.

Papillomavirus,Human；Prevalence；Gene

劉宏圖，Email：liuht@chinacdc.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.04.007

重大傳染病應急處置檢測技術平臺(2013ZX10004-101)

2016-04-19)