郭仲杰，李洪榮，陳美元，蔡志欣，廖劍華

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所 特色食用菌繁育與栽培國家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 福州 350014）

雙孢蘑菇培養(yǎng)料中纖維素降解菌的分離與純化*

郭仲杰，李洪榮，陳美元，蔡志欣，廖劍華

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所 特色食用菌繁育與栽培國家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 福州 350014）

實(shí)驗(yàn)從雙孢蘑菇一、二次發(fā)酵培養(yǎng)料樣品中，分離篩選出10株有降解纖維素能力的菌株。經(jīng)過透明圈直徑、酶相對活性、濾紙酶活力和羧甲基纖維素酶活力的測定、比較，復(fù)篩出3株降解纖維素能力相對較強(qiáng)的菌株，分別是Ⅱ-4、Ⅱ-5、Ⅱ-6。

雙孢蘑菇；培養(yǎng)料；纖維素降解菌；酶活力

在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，每年產(chǎn)生了大量的農(nóng)作物秸桿如小麥秸桿、稻草等，由于其主要成分木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，難以有效利用，除少量用作飼料，大部分都是被直接焚燒、廢棄，不僅造成巨大的資源浪費(fèi),而且還引起了嚴(yán)重的環(huán)境污染問題[1-3]。近年來，迅速發(fā)展的食用菌產(chǎn)業(yè)對秸桿的利用發(fā)揮了重大作用，用來栽培雙孢蘑菇[4]、巴西蘑菇[5]等多種食用菌，菌渣回田，變廢為寶，實(shí)現(xiàn)無害化循環(huán)利用。

雙孢蘑菇[Agaricus bisporus (J.E. Lange) Imbach]是一種草腐生食用菌[6]，其菌絲不能直接利用纖維素，秸桿必須經(jīng)過堆制發(fā)酵才能被利用。培養(yǎng)料堆制發(fā)酵是在一定的環(huán)境條件下，由原料自身或空氣中所帶有的微生物的生長代謝而引發(fā)的一種高溫、好氧的生物降解過程；微生物繁殖活動(dòng)是降解或轉(zhuǎn)化纖維素的關(guān)鍵。本研究將雙孢蘑菇培養(yǎng)料樣品進(jìn)行分離，篩選出纖維素降解菌，并對其酶活力和對纖維素的降解能力的測定，復(fù)篩出高效纖維素降解菌，用于雙孢蘑菇培養(yǎng)料的促酵作用和發(fā)酵質(zhì)量的檢測研究。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集與預(yù)處理

采集不同發(fā)酵階段、不同位置的雙孢蘑菇培養(yǎng)料樣品。分別放入三角瓶中，加入適量無菌水和玻璃珠，振蕩30min,無菌紗布過濾，提取清液，以備待用。

1.2 培養(yǎng)基和試劑的配制

纖維素篩選培養(yǎng)基[7]：蛋白胨10.0g，酵母膏10.0g，羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）10.0g，NaCl 5.0g，KH2PO4 1.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1000mL。

鑒別培養(yǎng)基（纖維素剛果紅培養(yǎng)基）[8]：纖維粉1.88g，KH2PO4 0.50g，MgSO4·7H2O 0.5115g，剛果紅0.20g，瓊脂16.0g，明膠2.0g，雙孢蘑菇培養(yǎng)料浸出汁100mL，pH值7.0。

液體培養(yǎng)基[9]：蛋白胨3.0g，酵母膏0.50g，羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）5.0g，NaCl 5g，KH2PO4 4.0g，MgSO4·7H2O 0.3g，CaCl·2H2O 0.3 g，pH值7.2～7.3 蒸餾水1000mL。

試劑：按照文獻(xiàn)[10]分別配制3,5-二硝基水楊酸試劑（DNS試劑）、檸檬酸緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液和1mg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 纖維素降解菌的分離、篩選及純化[11-12]

將樣品清液的10-3、10-4、10-5倍稀釋液均勻涂布于纖維素篩選平板培養(yǎng)基上，50℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3～5d，隨時(shí)觀察。及時(shí)將平板上的菌落挑取，劃線分離得到的單菌落，接種于纖維素剛果紅培養(yǎng)基上，50℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3～7d。挑選出在平板上生長快，透明水解圈大的單菌落，接種于CMC斜面培養(yǎng)基上，保藏，以備進(jìn)一步研究。

1.4 纖維素降解菌酶活力測定

1.4.1 纖維素降解菌酶相對活性測定

將分離純化得到的單個(gè)菌株分別接種于纖維素剛果紅培養(yǎng)基上，50℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)5d，并測定記錄透明圈直徑(D)和菌落直徑(d)大小。

酶相對活性(A)=D/d

1.4.2 酶活力的測定[13]

1.4.2.1 粗酶液的制備

將分離到的菌株分別接種到裝有200ml液體培養(yǎng)基的三角瓶中，50℃，180r·min-1振蕩培養(yǎng)5 d，將培養(yǎng)液于4℃，4000r·min-1離心15 min，取上清液作為粗酶液。

1.4.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用3,5-二硝基水楊酸比色定糖法測定酶解液中還原糖的含量。分別取1mg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6mL，依次加入9支20mL的比色試管中，用蒸餾水稀釋到2.0mL，再加入DNS試劑1.5mL，在100℃水浴5min，冷卻，用蒸餾水定容至20mL搖勻，在波長520nm 處進(jìn)行比色測定，用空白管溶液調(diào)零點(diǎn)，記錄吸光度值，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2.3 濾紙酶活力測定

取0.15mol·L-1HAc-NaAc緩沖液1.5mL，加入新華定量濾紙1條（1cm×6cm、50±1mg），再加入粗酶液0.5mL，搖勻，濾紙浸泡在液體中，50℃水浴保持1h，按DNS法測定糖。

以1mL酶液60min催化水解生成 1μmol葡萄糖的所需的酶量為1個(gè)酶活力單位，單位為U。

1.4.2.4 羧甲基纖維素酶 ( CMC) 酶活力測定

試管中加入1.5mL含0.5% CMC-Na的檸檬酸緩沖液，再移取入0.5mL粗酶液，搖勻，50℃水浴反應(yīng)30min后，按DNS法測定糖。

以1mL酶液30min催化水解生成 1μmol葡萄糖的所需的酶量為1個(gè)酶活力單位，單位為U。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌的分離與純化、篩選

使用結(jié)構(gòu)簡單，較易降解的羧甲基纖維素鈉作為單一碳源的選擇性培養(yǎng)基，進(jìn)行初步篩選纖維素降解菌。用1mol·L-1的HCl染色，如果菌株有降解纖維素能力，則會(huì)水解雙糖，紅色水解圈沉淀變?yōu)樯钏{(lán)色，說明該菌株是纖維素降解菌。按此方法，分離得到36株具有降解纖維素能力的菌株，其中從一次發(fā)酵培養(yǎng)料篩選出11株，二次發(fā)酵培養(yǎng)料篩選出25株，結(jié)果表明二次發(fā)酵培養(yǎng)料內(nèi)優(yōu)勢生長的纖維素降解菌多于一次發(fā)酵培養(yǎng)料。

將分離純化得到的36株纖維素降解菌接種在纖維素剛果紅平板培養(yǎng)基上，50℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)5d，觀測其透明圈的直徑并計(jì)算其相對酶活力，篩選出10株相對分解能力較強(qiáng)的菌株，分別命名為Ⅰ-1，Ⅰ-2，Ⅰ-3，Ⅱ-1，Ⅱ-1，Ⅱ-2，Ⅱ-3，Ⅱ-4，Ⅱ-5，Ⅱ-6，Ⅱ-7（Ⅰ代表一次發(fā)酵培養(yǎng)料，Ⅱ代表二次發(fā)酵培養(yǎng)料）。

2.2 纖維素降解菌酶活力測定

剛果紅纖維素平板透明圈篩選法簡便、快速、直接，如果作為唯一定量指標(biāo)，其精確度不可靠，需要配合其他方法。纖維素酶活力是衡量菌株降解纖維素能力的一個(gè)定量指標(biāo)，酶活力越高，菌株降解纖維素的能力就越強(qiáng)。分別對10株纖維素降解菌進(jìn)行透明圈測定、酶相對活力、濾紙酶活力和CMC酶活力進(jìn)行測定，結(jié)果如表1。

表1的測定結(jié)果表明，酶相對活力最大是Ⅱ-4，濾紙酶活力最大是Ⅱ-6， CMC酶活力最大是Ⅱ-5。各菌株的透明圈大小、酶相對活性、濾紙酶活力和CMC酶活力的測定結(jié)果一致性較好。另外CMC酶活力高的菌株，其濾紙酶活力，CMC 酶活力也高。

通過纖維素選擇培養(yǎng)基初篩，剛果紅纖維素平板透明圈篩選和液體發(fā)酵篩選的復(fù)篩，再進(jìn)行培養(yǎng)、酶活測定的驗(yàn)證，能夠快速、準(zhǔn)確、有效地篩選出高纖維素降解能力的菌株。剛果紅纖維素平板透明圈篩選法可用于識(shí)別產(chǎn)纖維素降解酶的菌株外，還可用于初步判定酶活力的高低，大大地減輕了篩選工作量。

表1 菌株不同指標(biāo)的測定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在雙孢蘑菇培養(yǎng)料堆制發(fā)酵過程中，有大量的纖維素降解菌繁殖活動(dòng)，分離出38株具有降解纖維素能力菌株，初篩出10株在酶活力較好的菌株，復(fù)篩出3株降解纖維素能力相對較強(qiáng)的菌株，分別是Ⅱ-4、Ⅱ-5、Ⅱ-6。

雙孢蘑菇培養(yǎng)料主原料是農(nóng)作物秸桿，主要成分為纖維素和木質(zhì)素。雙孢蘑菇菌絲不能直接利用纖維素和木質(zhì)素，原料必須堆制發(fā)酵，經(jīng)過纖維素降解菌和木質(zhì)素降解菌的降解作用，制造出適合雙孢蘑菇菌絲生長的特異性基質(zhì)。在這過程中，雙孢蘑菇培養(yǎng)料的物理結(jié)構(gòu)的變化和化學(xué)成分的轉(zhuǎn)化與微生物的繁殖活動(dòng)復(fù)雜地結(jié)合在一起。本試驗(yàn)篩選出的菌株，可用于配制雙孢蘑菇的促酵劑，對增加纖維素降解菌的繁殖優(yōu)勢，提高培養(yǎng)料質(zhì)量，增加雙孢蘑菇生產(chǎn)效益有重大意義。試驗(yàn)對研究雙孢蘑菇培養(yǎng)料內(nèi)降解菌繁殖活動(dòng)變化情況，探索培養(yǎng)料發(fā)酵質(zhì)量的檢測新方法提供了基礎(chǔ)。

[1] 聶麥茜,劉加昌,朱玉璽,等.纖維素降解菌篩選分離與CMC酶提取及其活性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008,36（19）:7956-7958,8002.

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10.3969/j.issn.1007-550X.2016.12.002

S646.9

A

1007-550X（2016）12-0042-04

福建省科技廳公益類項(xiàng)目（2014R1020-6），“十二五”國家科技支撐計(jì)劃“東南地區(qū)農(nóng)牧廢棄物多級(jí)循環(huán)利用技術(shù)集成與示范”(2012BAD14B15-401)

2016-10-18

郭仲杰（1974-），男，高級(jí)工程師，主要從事食用菌遺傳育種及栽培的研究。

廖劍華，E-mail：1145698891@qq.com