鄭洛昀,辛嘉英,王 艷,鄧永平,么婷婷
(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,黑龍江省普通高等學(xué)校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150076)
醋糟發(fā)酵紅酵母產(chǎn)類胡蘿卜素的研究
鄭洛昀,*辛嘉英,王艷,鄧永平,么婷婷
(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,黑龍江省普通高等學(xué)校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱150076)
以醋糟為原料,用酶解法和酸解法對(duì)醋糟進(jìn)行水解產(chǎn)生還原糖,用單因素試驗(yàn)和L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化了酶解條件和酸解條件,最終得到酶解還原糖產(chǎn)率為33.89%,酸解還原糖產(chǎn)率為39.46%;用范氏法對(duì)其纖維素進(jìn)行測(cè)定,用水解后的醋糟培養(yǎng)紅酵母,以醋糟直接培養(yǎng)紅酵母為對(duì)照;得到醋糟酶解后發(fā)酵紅酵母產(chǎn)類胡蘿卜素達(dá)到19.94 mg/g,酸解醋糟后培養(yǎng)紅酵母產(chǎn)類胡蘿卜素達(dá)到17.61 mg/g。經(jīng)分析及數(shù)據(jù)處理得出,相對(duì)于酸解和直接在醋糟上培養(yǎng)紅酵母,酶解法較好些。
醋糟;紅酵母;水解;發(fā)酵;還原糖
廢棄的醋糟是谷物固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)醋的副產(chǎn)品。我國(guó)是產(chǎn)醋大國(guó),每年食醋生產(chǎn)企業(yè)有200×104t醋糟的產(chǎn)生[1]。目前,醋糟利用方式主要是作為飼料和培養(yǎng)基原料[2],作為飼料醋糟在反芻動(dòng)物和草食動(dòng)物飼料中主要直接用于配制動(dòng)物日糧、替代部分其他飼料,以降低成本。楊致玲等人[3]著重分析了醋糟中一些常見(jiàn)的營(yíng)養(yǎng)成分,得到醋糟中的粗蛋白含量約11.45%,粗脂肪12.78%,粗纖維29.63%,粗灰分14.6%,鈣0.42%,磷0.19%。醋糟中蛋白質(zhì)、淀粉含量較低,而粗纖維含量較高,工業(yè)上可回收利用。醋糟直接飼喂動(dòng)物,適口性較差,且其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率太低。醋糟中纖維素結(jié)構(gòu)緊密,微生物難以降解[4]。因此,水解是含纖維資源開(kāi)發(fā)利用的關(guān)鍵步驟之一。而硫酸水解法和酶降解法是目前纖維質(zhì)原料糖化常用的方法,酸解可以直接將木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)生單糖,也可作為酶解的預(yù)處理方法,而且具有較好的可操作性和經(jīng)濟(jì)可行性。飼用酶制劑可以降低飼料黏度,顯著提高動(dòng)物對(duì)飼料的消化能力,提高飼料的消化率和利用率;而且酵母菌細(xì)胞蛋白質(zhì)含量高,是生產(chǎn)富含蛋白質(zhì)的飼料的常用菌株。
目前,紅酵母的應(yīng)用已非常廣泛,它常被作為一種極為有效增色劑用于禽類,例如使雞、鴨的蛋黃顏色加深等。本文主要在醋糟上培養(yǎng)紅酵母產(chǎn)類胡蘿卜素,從而改變飼料適口性和提高飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。
1.1材料
紅酵母AS2.2241,選自哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。
醋糟,哈爾濱正陽(yáng)河醋廠提供。
1.2主要儀器
SPX-100B-Z型生化培養(yǎng)箱,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品;QE-2型臺(tái)式恒溫?fù)u床,天津市歐諾儀器儀表有限公司產(chǎn)品;電熱鼓風(fēng)干燥箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;ESJ 180-4型電子天平,賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;HW SY11-K型電熱恒溫水浴鍋,北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司產(chǎn)品;TGL-16G型臺(tái)式低速離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品;AR1140型電子分析天平,奧豪斯國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司產(chǎn)品;WFZ UV-2000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),龍尼柯(上海)儀器有限公司產(chǎn)品;DF-1型集熱式磁力攪拌器,常州丹瑞實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,德國(guó)IKA公司產(chǎn)品。
1.3主要試劑及配制
(1)酶。酸性纖維素酶(酶比活150 000 kg)、硫酸(分析純)、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、瓊脂、丙酮、DNS試劑、中性洗滌劑(3%十二烷基硫酸鈉)、酸性洗滌劑(2%十六三甲基溴化銨)、氫氧化鈉、酸洗石棉、95%乙醇(化學(xué)純)、乙醚(化學(xué)純)、正辛烷(分析純)、十氫化萘。
(2)中性洗滌劑。準(zhǔn)確稱取18.6 g乙二胺四乙酸二鈉(EDTA,分析純)和6.8 g硼酸鈉(分析純)放入燒杯中,加入少量蒸餾水,加熱溶解后,再加入30 g十二烷基硫酸鈉(分析純)和10 mL乙二醇乙醚(分析純);再稱取4.56 g無(wú)水磷酸氫二鈉(分析純)置于另一燒杯中,加入少量蒸餾水微微加熱溶解后,倒入前一個(gè)燒杯中,在容量瓶中稀釋至1 000 mL,其中pH值約為6.9~7.1(pH值一般勿需調(diào)整);硫酸:量取約27.87 mL濃硫酸(分析純,比重1.84,98%),徐徐加入已裝有500 mL蒸餾水的燒杯中,冷卻后注入1 000 mL容量瓶中定容,標(biāo)定。
(3)酸性洗滌劑(2%十六烷三甲基溴化銨)。稱取20 g十六烷三甲基溴化銨(CTAB,分析純)溶于1 mol/L硫酸,必要時(shí)過(guò)濾。
(4)3,5-二硝基水楊酸試劑。稱取6.3 g 3,5-二硝基水楊酸,量取262 mL 2 mol/L NaOH溶液,將其加入預(yù)熱的含有185 g酒石酸鉀鈉溶液(500 mL)中,攪拌均勻后準(zhǔn)確加入6.25 mL苯酚和5 g Na2SO3,攪拌使其充分溶解。待其完全冷卻,轉(zhuǎn)移至1 000 mL的棕色容量瓶中,加水定容,保存?zhèn)溆谩?/p>
1.4紅酵母液體種子培養(yǎng)
用適量無(wú)菌水將菌苔洗下,吸取1 mL接種于含有50 mL液體種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,于30℃,150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h。
2.1試驗(yàn)方法
2.1.1醋糟酶解條件的優(yōu)化
準(zhǔn)確稱取10 g干醋糟于250 mL的三角瓶中,添加不同量的酸性纖維素酶、不同量的蒸餾水,把裝好的三角瓶于搖床(轉(zhuǎn)速為150 r/min)中分別以不同酶解溫度、不同酶解時(shí)間下進(jìn)行酶解。以還原糖產(chǎn)率為指標(biāo),確定最佳單因素進(jìn)行正交分析,確定酶水解醋糟產(chǎn)還原糖的最優(yōu)條件。酶解后,在沸水浴上滅酶15 min以上,迅速冷卻,離心后取適量上清液于紫外分光光度計(jì)測(cè)還原糖吸光度,計(jì)算還原糖含量。把測(cè)完樣品倒回三角瓶,為培養(yǎng)紅酵母菌種備用。
2.1.2醋糟酸解條件的優(yōu)化
準(zhǔn)確稱取10 g干醋糟于250 mL的三角瓶中,將轉(zhuǎn)子放在三角瓶?jī)?nèi),分別以不同硫酸濃度、不同固液比,將其于水浴鍋中以不同酸解時(shí)間、不同酸解溫度為單因素進(jìn)行酸解;以還原糖產(chǎn)率為指標(biāo),確定最優(yōu)因素;做正交試驗(yàn)分析,得到酸水解產(chǎn)還原糖的最優(yōu)條件。然后用3 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至中性,備用。
2.1.3紅酵母菌在醋糟中的培養(yǎng)
用滅菌后的移液管準(zhǔn)確吸取1 mL(約1×107個(gè))紅酵母菌液于水解后的醋糟中,于28℃下培養(yǎng)48 h,經(jīng)45℃烘干后測(cè)定類胡蘿卜素含量。
2.2測(cè)定方法
2.2.1還原糖及含量的測(cè)定——DNS法
配制2 mg/mL的溶液適量混勻,分別取0.2,0.4,0.6,0.8,1 mL葡萄糖液于6支試管,加蒸餾水1.8,1.6,1.4,1.2,1.0 mL,再向1~5號(hào)試管中分別加入2 mL DNS溶液。各試管充分混合均勻,置于沸水浴5 min,迅速冷卻,定容至25 mL,振蕩使其混合均勻。以不加葡萄糖的蒸餾水為對(duì)照,分別測(cè)定1~5號(hào)試管于540 nm波長(zhǎng)下的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)、葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并用最小二乘法進(jìn)行回歸得到回歸方程Y=0.037X+ 0.061,其中Y為OD540,R2=0.997 1。
2.2.2酵母細(xì)胞破碎方法——酸熱破壁法
用蒸餾水將烘干至恒質(zhì)量的酵母細(xì)胞移至45 mL離心管,以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心10 min,去上清液,吸取10 mL鹽酸(3 mol/L) 加入濕菌體中,振蕩45 min使其充分混勻,置于100℃沸水中加熱5 min,快速取出后冷卻。
2.2.3類胡蘿卜素的提取——丙酮提取法
將經(jīng)(1.4)處理后的菌體,以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心10 min,去上清液,沉淀洗滌2次,并用吸水紙吸去多余水分。吸取15 mL丙酮加至沉淀中,于30℃條件下振蕩提取20 min,以轉(zhuǎn)速9 000 r/min離心15 min,取上清液。如提取不充分,再加適量丙酮進(jìn)行提取,直至菌體呈現(xiàn)無(wú)色。合并上清液,適當(dāng)稀釋后用WFZ UV-2000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定其于波長(zhǎng)475 nm處吸光度。按下式計(jì)算類胡蘿卜素產(chǎn)量:
式中:Aλmax——色素最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度;
D——測(cè)定試樣的稀釋倍數(shù)“1”;
V——提取色素用有機(jī)溶劑體積,mL;
W——發(fā)酵液體積,mL;
0.16——類胡蘿卜素的摩爾消光系數(shù),L/(mg·cm)。
在上式中W指發(fā)酵液體積,則計(jì)算結(jié)果單位是μg/mL,即mg/L。
2.2.4纖維素的測(cè)定方法——范氏(Van Soest)法
纖維素的測(cè)定按照范氏(Van Soest)中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維的方法測(cè)定[5]。
3.1單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析
(1) 還原糖含量的測(cè)定。根據(jù)2.2.1的操作步驟,采用DNS法測(cè)定不同葡萄糖質(zhì)量濃度下的吸光度A,其中Y=0.037X+0.061,R2=0.997 1。
DNS法測(cè)定還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。
圖1 DNS法測(cè)定還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線
(2)固液比的確定。取纖維素酶0.55 g,酶解溫度50℃,在搖床中振動(dòng)酶解48 h。
固液比對(duì)還原糖產(chǎn)率的影響見(jiàn)圖2。
由圖2可知,在一定范圍內(nèi),還原糖產(chǎn)率隨固液比增大而增加,當(dāng)固液比為1∶5時(shí)達(dá)到最大,其后還原糖產(chǎn)率逐漸降低,可能是由于固液比增大纖維素酶濃度降低,纖維素酶與醋糟結(jié)合率變小的緣故,所以最佳固液比為1∶5。
圖2 固液比對(duì)還原糖產(chǎn)率的影響
(3)酶用量的確定。
酶用量對(duì)還原糖產(chǎn)率的影響見(jiàn)圖3。
圖3 酶用量對(duì)還原糖產(chǎn)率的影響
由圖3可知,還原糖產(chǎn)率隨酶用量的增加而增加,當(dāng)酶用量達(dá)到0.65 g時(shí)還原糖產(chǎn)率達(dá)到最大;隨后還原糖產(chǎn)率有所下降,這可能是因?yàn)樵S多酶在底物濃度超過(guò)一定限度時(shí)反應(yīng)速度減弱,纖維素酶接近飽和,所以最佳酶用量為0.65 g。
(4)酶解溫度的確定。
酶解溫度對(duì)還原糖產(chǎn)率的影響見(jiàn)圖4。
圖4 酶解溫度對(duì)還原糖產(chǎn)率的影響
由圖4知,還原糖產(chǎn)率隨酶解溫度的升高,還原糖產(chǎn)率平緩升高,當(dāng)?shù)?0℃后還原糖產(chǎn)率迅速下降,原因可能是由于酶解溫度過(guò)高,對(duì)酶反應(yīng)有抑制作用,并且酶解溫度過(guò)高導(dǎo)致纖維素酶失活,從而還原糖產(chǎn)率迅速下降,所以最優(yōu)酶解溫度為50℃。
(5)酶解時(shí)間的確定。
酶解時(shí)間對(duì)還原糖產(chǎn)率的影響見(jiàn)圖5。
由圖5可知,醋糟隨著酶解時(shí)間的變長(zhǎng),還原糖產(chǎn)率逐漸增多,當(dāng)48 h時(shí)達(dá)到最大,隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng),還原糖產(chǎn)率下降,可能是因?yàn)殡S酶解時(shí)間的延長(zhǎng),底物濃度降低,產(chǎn)物濃度過(guò)高會(huì)對(duì)水解反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用。所以,當(dāng)酶解時(shí)間48 h,固液比1∶5,酶用量0.65 g,酶解溫度50℃,還原糖產(chǎn)率最多為33.1%,確定最適酶解時(shí)間為48 h。
圖5 酶解時(shí)間對(duì)還原糖產(chǎn)率的影響
通過(guò)對(duì)單個(gè)因素的分析,確定較好的發(fā)酵條件,然后利用正交試驗(yàn)分析方法,進(jìn)行正交試驗(yàn)。
3.2酶解正交試驗(yàn)結(jié)果
為了進(jìn)一步優(yōu)化酶解條件,設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn),以確定最優(yōu)條件。
正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 正交試驗(yàn)結(jié)果
由表1可知,各因素對(duì)酶解的影響大小次序?yàn)锽>A>D>C,優(yōu)選方案為 A2B2C3D3,該組合并不在9次試驗(yàn)中,所以對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示,在最佳組合條件下,酶解還原糖產(chǎn)率為33.89%;綜合考慮極差分析結(jié)果,最佳優(yōu)選方案為A2B2C3D3,即酶解溫度50℃,酶用量0.65 g,固液比1∶5,酶解時(shí)間48 h。通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn),此結(jié)果正確。
3.3酸解因素優(yōu)化及分析
3.3.1酸解單因素水平的確定
(1)硫酸濃度的確定。
硫酸濃度對(duì)還原糖產(chǎn)率的影響見(jiàn)圖6。
由圖6可知,酸解過(guò)程中,隨著硫酸濃度的不斷增加,樣品中還原糖產(chǎn)率先增加后下降,可能是因?yàn)榱蛩徇_(dá)到一定濃度時(shí),一些已經(jīng)溶解的醋糟又炭化而出現(xiàn)沉淀;并且加大硫酸濃度使得醋糟顏色加深,高濃度的硫酸還會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。所以,硫酸濃度為8%時(shí)還原糖產(chǎn)率最高。
圖6 硫酸濃度對(duì)還原糖產(chǎn)率的影響
(2)固液比的確定。
底物與硫酸的比例對(duì)還原糖產(chǎn)率的影響見(jiàn)圖7。
圖7 底物與硫酸的比例對(duì)還原糖產(chǎn)率的影響
由圖7可知,隨著固液比的增加,醋糟中纖維素的降解增大,還原糖產(chǎn)率也隨之變大;當(dāng)固液比為1∶10時(shí)達(dá)到最大,隨后降低。分析原因,可能是硫酸過(guò)多水解液中的還原糖產(chǎn)率降低。綜合考慮,當(dāng)固液比為1∶10時(shí)最佳。
(3)酸解時(shí)間的確定。
酸解時(shí)間對(duì)還原糖產(chǎn)率的影響見(jiàn)圖8。
圖8 酸解時(shí)間對(duì)還原糖產(chǎn)率的影響
由圖8可知,隨酸解時(shí)間變長(zhǎng),當(dāng)?shù)?0 min時(shí),還原糖產(chǎn)率達(dá)到最大。酸解過(guò)程中,隨著酸解時(shí)間的不斷延長(zhǎng),還原糖產(chǎn)率先升高后降低,然后趨于平緩。分析其原因,可能是由于醋糟長(zhǎng)時(shí)間在水浴鍋中,其纖維素已經(jīng)完全降解。
(4)酸解溫度的確定。
酸解溫度對(duì)還原糖產(chǎn)率的影響見(jiàn)圖9。
由圖9可知,酸解過(guò)程中,隨著酸解溫度的不斷升高,還原糖產(chǎn)率逐漸增高,并且于120℃時(shí)還原糖產(chǎn)率最高。分析其原因,可能是高溫的條件下醋糟中有部分難以分解的物質(zhì)發(fā)生分解,使得酸解更完全、更徹底。
圖9 酸解溫度對(duì)還原糖產(chǎn)率的影響
通過(guò)對(duì)單個(gè)因素的分析,確定較好的發(fā)酵條件,然后利用正交試驗(yàn)確定最優(yōu)方案。
3.3.2酸解正交試驗(yàn)結(jié)果
為了進(jìn)一步優(yōu)化酸解條件,設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn),以確定的最優(yōu)條件。
正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 正交試驗(yàn)結(jié)果
由表2可知,各因素對(duì)酸解的影響大小次序?yàn)镈'>B'>C'>A',優(yōu)選方案為A'2B'2C'2D'1,該組合并不在9次試驗(yàn)中,所以對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示,在最佳組合條件下,酸解還原糖產(chǎn)率為39.46%;綜合考慮極差分析結(jié)果,最佳優(yōu)選方案為A'2B'2C'2D'1,即硫酸濃度8%,固液比1∶10,酸解時(shí)間60 min,酸解溫度120℃。通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn),此結(jié)果正確。
3.4纖維素的測(cè)定及比較分析
參照2.2.4的方法,對(duì)幾種纖維素進(jìn)行測(cè)定。
不同水解方法醋糟中纖維素及灰分的比較見(jiàn)表3。
由表3可知,醋糟酶解后CF,ADF,DNF分別降低了5.63%,11.4%,25.41%,醋糟酸解后CF,ADF,DNF分別降低了6.81%,37.1%,47.54%,同時(shí)灰分也有所減少。由還原糖產(chǎn)率的增長(zhǎng)纖維素含量的降低,可知有部分纖維素轉(zhuǎn)化成了還原糖。
表3 不同水解方法醋糟中纖維素及灰分的比較 /%
3.5醋糟培養(yǎng)紅酵母各指標(biāo)的測(cè)定及比較分析
按接菌量1×107個(gè)/瓶,于28℃條件下培養(yǎng)48 h,置于45℃條件下烘干后測(cè)定類胡蘿卜素含量,以未接菌的醋糟培養(yǎng)基為對(duì)照。測(cè)定類胡蘿卜素含量參照1.3.2和1.3.3的測(cè)定步驟。
產(chǎn)類胡蘿卜素的比較見(jiàn)表4。
表4 產(chǎn)類胡蘿卜素的比較
由表4可知,酸解醋糟產(chǎn)還原糖比酶解產(chǎn)還原糖要多,但是在接菌量一樣的情況下,酶解醋糟后比酸解醋糟后培養(yǎng)紅酵母產(chǎn)類胡蘿卜素要多。分析原因,可能是在酸解過(guò)程中,由于硫酸濃度過(guò)高,破壞了醋糟中的其他利于紅酵母生長(zhǎng)的成分,至使紅酵母生長(zhǎng)情況不好。
通過(guò)優(yōu)化得到,酶解最佳反應(yīng)條件下產(chǎn)還原糖33.89%,類胡蘿卜素產(chǎn)量為19.94 mg/g;酸解醋糟產(chǎn)還原糖39.46%,類胡蘿卜素產(chǎn)量為17.61 mg/g。綜合考慮,酸解過(guò)程中需要較高的溫度,并且操作較復(fù)雜;而酶解反應(yīng)比較溫和,且簡(jiǎn)單易操作,并且適合大批量工業(yè)生產(chǎn)。相對(duì)比較下,酶解醋糟培養(yǎng)紅酵母產(chǎn)類胡蘿卜素要比酸解產(chǎn)類胡蘿卜素要好。
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Production Carotenoids from Vinegar Residue by Rhodotorula
ZHENG Luoyun,*XIN Jiaying,WANG Yan,DENG Yongping,YAO Tingting
(Food and Engnineering College,Harbin Vniversity of Commerce,Key Laboratory of Food Science and Engineering Colleges and Vniversities in Heilingjiang Province,Harbin,Heilongjiang 150076,China)
This study use vinegar residue as the main material,the preparation of reducing sugar from vinegar residue is studied through acidic hydrolysis and enzymatic hydrolysis respectively.Single factor tests and orthogonal experiment designmethods L9(3)4areappliedtoanalyzetheinfluenceofhydrolysisconditionontheyieldofreducingsugarofthevinegarresidue. Under optimal conditions reducing sugar is 33.89%,the vinegar sugar is 39.46%obtained by acidic hydrolysis.Then the content of determined by Van Soest method.Culture of Rhodotorula by hydrolysis of vinegar residue,and the Rhodotorula is directlycultured as the control.After the enzymatic hydrolysis,the carotenoid reached 19.94 mg/g.Carotenoid reached 17.61 mg/g after acidic hydrolysis.By analysis and data processing,the enzymatic hydrolysis is better than that of acidic hydrolysis and the direct culture of Rhodotorula in vinegar residue.
vinegar residue;Rhodotorula;hydrolysis;fermentation;reducing sugar
TQ920.6
A
10.16693/j.cnki.1671-9646(X).2016.08.030
1671-9646(2016)08b-0001-05
2016-06-28
鄭洛昀(1989— ),女,在讀碩士,研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。
辛嘉英(1966— ),男,博士,教授,研究方向?yàn)樯锎呋?/p>