魏　琴, 譚韻雅, 李　群*, 游　玲, 汪　超 , 王　玉， 廖　淋

( 1. 宜賓學(xué)院 香料植物資源開發(fā)與利用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 四川 宜賓 644000；2. 四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 成都 610101 )

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內(nèi)生真菌對油樟懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的影響

魏琴1, 譚韻雅2, 李群2*, 游玲1, 汪超2, 王玉1， 廖淋1

( 1. 宜賓學(xué)院 香料植物資源開發(fā)與利用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 四川 宜賓 644000；2. 四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 成都 610101 )

該文研究了內(nèi)生真菌YG42、YG71、YY11和YY26發(fā)酵液，對油樟懸浮細(xì)胞的生長量及揮發(fā)性代謝產(chǎn)物積累量的影響。結(jié)果表明：4種內(nèi)生真菌對油樟懸浮細(xì)胞的生長均有抑制作用，抑制強(qiáng)度隨發(fā)酵液添加量的增加而加強(qiáng)。4種內(nèi)生真菌對油樟懸浮細(xì)胞揮發(fā)性代謝產(chǎn)物積累總量及1,8-桉葉油素、γ-葉松油烯和α-油松油醇3種油樟油組分物質(zhì)積累量的影響多表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)高濃度抑制的趨勢。其中，1%添加量的YG42和YY26及0.25%添加量的YY11對懸浮細(xì)胞總揮發(fā)性代謝產(chǎn)物積累的促進(jìn)作用相當(dāng)且最強(qiáng)，其積累量分別是空白組的2.00、1.95、2.01倍；0.25%添加量的YG71對1,8-桉葉油素積累的促進(jìn)作用最強(qiáng)，其積累量為空白組的11.03倍；0.25%添加量的YG71和YY26對α-松油醇積累的促進(jìn)作用相當(dāng)且最強(qiáng)，其積累量分別為空白組的1.72和1.81倍；對于γ-松油烯的積累，在空白組中未檢測到其峰值，4種真菌誘導(dǎo)子對γ-松油烯的產(chǎn)生有誘導(dǎo)作用，誘導(dǎo)的最大峰面積為0.19，誘導(dǎo)菌是0.25%添加量的YG71。該研究結(jié)果為充實(shí)內(nèi)生菌影響香料植物揮發(fā)性代謝產(chǎn)物合成理論奠定了基礎(chǔ)，也為生產(chǎn)上內(nèi)生真菌提高油樟油中有用物質(zhì)組分含量措施的采用提供了依據(jù)。

內(nèi)生真菌， 揮發(fā)性代謝產(chǎn)物， 懸浮培養(yǎng)， 1,8-桉葉油素， γ-松油烯, α-松油醇

植物內(nèi)生菌群落和宿主在長期協(xié)同進(jìn)化過程中，內(nèi)生真菌能產(chǎn)生某些物質(zhì)以快速、專一、選擇性地誘導(dǎo)植物代謝過程中某些基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)植物中代謝物質(zhì)的積累(譚燕等，2013)。由于內(nèi)生真菌與宿主植物之間存在基因水平轉(zhuǎn)移，使內(nèi)生菌與宿主植物有相似的代謝途徑，從而可能形成相同或相似的代謝產(chǎn)物或者宿主植物代謝產(chǎn)物的前體物質(zhì)，導(dǎo)致內(nèi)生菌對宿主細(xì)胞代謝產(chǎn)物產(chǎn)量有較大影響(朱國勝等，2005；Peters et al, 1998; Vijay et al, 2014; Yang et al, 2014)。某些真菌具有萜類生物轉(zhuǎn)化能力(Molina et al, 2013; Michael et al, 2009)。因此，以單萜、倍半萜、二萜等多種萜類物質(zhì)為主要成分的香料植物的芳香油的形成可能與內(nèi)生真菌有相關(guān)性。

油樟(Cinnamomumlongepaniculatum)為樟科(Lauraceae)樟屬(Cinnamomum)常綠喬木，是重要的經(jīng)濟(jì)作物，其根、莖、葉、種子均可提取芳香油。油樟葉中提取的芳香油主要成分是萜類物質(zhì)，占芳香油在85%以上(胡文杰等，2012)。其中，已報(bào)道有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的成分有1,8-桉葉油素，γ-松油烯，α-松油醇等(Li et al, 2014)。游玲等(2009)研究表明，油樟內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物中存在大量油樟油組分中的單萜組分、其類似物或前體物質(zhì)，并推測油樟內(nèi)生真菌參與了油樟油的形成過程。關(guān)于油樟油中有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的1,8-桉葉油素，γ-松油烯，α-松油醇等的形成是否與內(nèi)生真菌有密切關(guān)系尚未見有研究報(bào)道。基于此，本研究以懸浮培養(yǎng)系為對象，以分離到的內(nèi)生真菌為誘導(dǎo)子，通過研究內(nèi)生真菌對懸浮細(xì)胞揮發(fā)性物質(zhì)積累及相關(guān)萜類物質(zhì)積累的影響情況，以期探討內(nèi)生真菌與1,8-桉葉油素，γ-松油烯，α-松油醇等萜類物質(zhì)積累的相關(guān)性。這對充實(shí)內(nèi)生菌影響香料植物萜類物質(zhì)等揮發(fā)性代謝產(chǎn)物合成理論有積極意義，也對生產(chǎn)上內(nèi)生真菌提高油樟油中有用物質(zhì)組分含量措施的采用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1 材料與儀器

內(nèi)生真菌YG42(從油樟根中分離的真菌，編號為42，初步鑒定為初步鑒定為稀絲頭孢霉屬Haplotrichum)、YG71(從油樟根中分離的真菌，編號為71，腫節(jié)暗孢霉屬Oedemium)、YY11(從油樟葉中分離的真菌，編號為11，有待鑒定)和YY26(從油樟葉中分離的真菌，編號為26，初步鑒定為擬內(nèi)孢霉屬Endomycopsis)由宜賓學(xué)院香料植物資源開發(fā)與利用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；1,8-桉葉油素(0.5 mL·支-1，HPLC≥99%)、α-松油醇(0.1 g·支-1，98%)和γ-松油烯(1 g·支-1，GC 95%)三種標(biāo)品在北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司購回。

采用氣相色譜儀[Agilent7890A、火焰離子化檢測器(FID)]。

1.2 方法

1.2.1 油樟懸浮細(xì)胞系建立參照魏琴等(2008)的配方進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)。培養(yǎng)基配方是B5 + NAA 0.5 mg·L-1+ 6-BA 2.0 mg·L-1+ 蔗糖3%+瓊脂0.7%，pH 5.8。將愈傷組織(約2 g鮮重)接種到40 mL液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25 ℃，搖床轉(zhuǎn)速110 r·min-1。每20 d繼代1次，連續(xù)繼代3次，直至愈傷組織較為疏松后用于建立懸浮培養(yǎng)體系。

1.2.2 內(nèi)生真菌發(fā)酵液制備將內(nèi)生真菌YG42、YG71、YY11和YY26接種于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)4 d， 無菌水洗脫孢子， 制成濃度為107個(gè)孢子·mL-1的孢子懸液，接種1 mL于含40 mL液體培養(yǎng)基(麥芽浸膏20 g，葡萄糖20 g，蛋白胨1 g，pH 5)的三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速為150 r·min-1，28 ℃培養(yǎng)8 d。超聲波破碎，備用。

圖 1　混合標(biāo)樣GC圖　a. 1,8-桉葉油素，出峰時(shí)間為2.840 min； b. γ-松油烯，出峰時(shí)間為3.167 min; c. α-松油醇，出峰時(shí)間為5.325 min。Fig. 1　Chromatograms for mix standard　The retention time of 1,8-cineole (a),γ-Terpinene (b) and α-Terpineol (c) is 2.840, 3.167 and 5.325 min, respectively.

1.2.3 1,8-桉葉油素、γ-松油烯和α-松油醇3 種物質(zhì)混和標(biāo)樣的制備與檢測稱取0.5 g 1,8-桉葉油素、γ-松油烯和α-松油醇標(biāo)品，分別置于50 mL容量瓶中用乙醇定容，制成10 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取配好的10 g·L-1的3種標(biāo)準(zhǔn)溶液，用超純水稀釋配制成濃度為0.001 g·L-1的混和標(biāo)樣。取10 mL培養(yǎng)物頂空進(jìn)樣，氣相色譜檢測。

1.2.4 內(nèi)生真菌對懸浮細(xì)胞生長和揮發(fā)性物質(zhì)積累的影響試驗(yàn)分三輪進(jìn)行。第一輪：在液體培養(yǎng)基中分別添加濃度為1%(100 mL懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基中添加1 mL內(nèi)生真菌發(fā)酵液，以下同)、4%、7%、10%的4種內(nèi)生真菌發(fā)酵液，以不加內(nèi)生真菌發(fā)酵液的懸浮培養(yǎng)系作為空白組，121 ℃高壓滅菌18 min。待冷卻后，將愈傷組織(2 g鮮重)接種到含不同濃度發(fā)酵液的40 mL液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)。每組重復(fù)3瓶，搖床轉(zhuǎn)速110 r·min-1，25 ℃條件下培養(yǎng)20 d后，進(jìn)行生物量的測定；取10 mL培養(yǎng)物頂空進(jìn)樣，氣相色譜檢測。在此試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，進(jìn)行第二輪試驗(yàn)：在液體培養(yǎng)基中分別添加濃度為0.1%、0.25%、0.5%、0.75%、1%的4種內(nèi)生真菌發(fā)酵液，以不加內(nèi)生真菌發(fā)酵液的懸浮培養(yǎng)系作為空白組，接種、滅菌、培養(yǎng)、檢測等方法同上。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行第三輪試驗(yàn)：選擇上兩輪試驗(yàn)中的關(guān)鍵性濃度0.1%、0.25%、1%、4%、10%的4種內(nèi)生真菌添加量重復(fù)以上試驗(yàn)以驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果。方法同上。

1.2.4.1 生物量的測定將懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物抽濾，取細(xì)胞，置于烘箱中45 ℃干燥至恒重，稱其質(zhì)量為細(xì)胞干重。每組重復(fù)3次。

1.2.4.2 氣相色譜檢測條件HP-5(30 m × 320 μm × 0.25 μm)毛細(xì)管柱，平衡溫度95 ℃，平衡時(shí)間20 min。載氣為氮?dú)?，氫氣流?0 mL·min-1，空氣流速400 mL·min-1，氮?dú)馕泊禋?5 mL·min-1，頂空進(jìn)樣，分流比3.0。柱箱程序： 先90 ℃保持4 min，再20 ℃·min-1到130 ℃保持5 min，然后20 ℃·min-1到190 ℃保持1 min，最后20 ℃·min-1到240 ℃保持1 min。每組重復(fù)3次。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理以峰面積表示各物質(zhì)的產(chǎn)量，其中總揮發(fā)性次生代謝產(chǎn)物以總峰面積表示。所有數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤即(x±s)表示。

2　結(jié)果與分析

2.1 混合標(biāo)樣GC分析

由混合標(biāo)品的氣相色譜檢測結(jié)果(圖1)可知，1,8-桉葉油素、r-松油烯和a-松油醇的出峰時(shí)間分別為2.840、3.167和5.325 min。圖1中相同的出峰時(shí)間被認(rèn)為是標(biāo)品相同的物質(zhì)。

2.2 4種內(nèi)生真菌對懸浮細(xì)胞生長的影響

4種內(nèi)生真菌對懸浮細(xì)胞的生長的影響見表1。

表 1　內(nèi)生真菌處理后懸浮細(xì)胞的生物量

注： 數(shù)據(jù)均為“平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤”，標(biāo)準(zhǔn)誤后面所帶字母表示其對比因素下的差異性，字母相同表示無差異，字母不同表示具有顯著差異，字母順序按所對比數(shù)據(jù)從大到小排列； 數(shù)據(jù)用SPSS 17.0處理分析，數(shù)據(jù)顯著性檢測在P≤0.05下多范圍Duncan檢測下獲得。下同。

Note： Data represent mean ± SE”， and the letters mean significant differences. Same letters mean no significant difference, and different letters mean contrary results. Data are tested (P≤0.05) according to Duncan’s multiple range test (DMRT) with SPSS 17.0. The same below.

方差分析表明，除濃度為0.1%的試驗(yàn)組外，其余所有試驗(yàn)組中的細(xì)胞干重與對照組相比都有顯著性差異。4種內(nèi)生真菌對懸浮細(xì)胞的生長均有一定的抑制作用，且抑制作用強(qiáng)度隨著真菌發(fā)酵液濃度的增加而增強(qiáng)。經(jīng)Duncan檢測得知，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，10%添加量的YY11真菌誘導(dǎo)子對懸浮細(xì)胞生長的抑制作用最強(qiáng)。

2.3 4種內(nèi)生真菌對懸浮細(xì)胞總揮發(fā)性代謝產(chǎn)物積累量的影響

4種內(nèi)生真菌對懸浮細(xì)胞總揮發(fā)性代謝產(chǎn)物積累量的影響見表2。表2顯示，經(jīng)4種內(nèi)生真菌誘導(dǎo)后懸浮細(xì)胞總揮發(fā)性代謝產(chǎn)物積累的量與空白相比，有顯著性差異?？傮w趨勢是低濃度促進(jìn)高濃度抑制，但不同內(nèi)生真菌起促進(jìn)作用的濃度是不一樣的。對于YG42和YY26在真菌濃度為1%時(shí)，其總峰面積最大，分別是空白的2.00和1.95倍；YY11在真菌濃度為0.25%時(shí)其總峰面積最大，為空白的2.01倍；YG71在所設(shè)實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)未出現(xiàn)促進(jìn)作用，而是呈接近空白(低濃度時(shí))或抑制作用(高濃度時(shí))，抑制強(qiáng)度隨著濃度的增加而增強(qiáng)。經(jīng)Duncan檢測得知， 1%添加量的YG42和YY26及0.25%添加量的YY11對總峰面積的影響無顯著性差異，其對懸浮細(xì)胞總揮發(fā)性代謝產(chǎn)物積累量的促進(jìn)作用相當(dāng)且最強(qiáng)。

2.4 4種內(nèi)生真菌對3種萜類物質(zhì)及其它物質(zhì)積累的影響

4種內(nèi)生真菌對懸浮細(xì)胞3種萜類物質(zhì)及其它物質(zhì)積累的影響見表3及圖2。經(jīng)4種內(nèi)生真菌誘導(dǎo)后3種萜類物質(zhì)積累的量與空白組相比，大部分有顯著性差異?？傮w影響與總揮發(fā)性物質(zhì)積累量相似， 同一內(nèi)生真菌對3種物質(zhì)表現(xiàn)為在低濃度條件下呈促進(jìn)作用或與空白接近，在高濃度條件下呈抑制作用。不同內(nèi)生真菌在同一濃度下，對3種萜類的作用效果不同；同一濃度下，不同內(nèi)生真菌對不同萜類物質(zhì)誘導(dǎo)效果有差異；對每一種萜類的誘導(dǎo)，要求的最佳內(nèi)生真菌的濃度是不一樣的。

對于1,8-桉葉油素的積累，YG42和YG26對其均呈抑制作用，YG71和YY11對其均表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)高濃度抑制的現(xiàn)象，且均是在濃度為0.25%促進(jìn)作用最強(qiáng)，此時(shí)1,8-桉葉油素的產(chǎn)量分別為空白組的11.03和1.59倍。經(jīng)Duncan檢測得知，其中促進(jìn)作用最強(qiáng)的是濃度為0.25%的YG71(圖2，表3)。

對于γ-松油烯的積累，在空白對照組中未檢測到其峰值。在0.25%添加量的4種真菌誘導(dǎo)子作用下，檢測到γ-松油烯有不同的峰值，其中峰面積最大的是0.19，其誘導(dǎo)菌是0.25%添加量的YG71。說明4種真菌誘導(dǎo)子對γ-松油烯的產(chǎn)生有誘導(dǎo)作用(表3)。

對于α-松油醇的積累， 4種真菌誘導(dǎo)子對松油醇積累均表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)高濃度抑制的現(xiàn)象，且均是在濃度為0.25%時(shí)其促進(jìn)作用最強(qiáng)，此時(shí)α-松油醇的產(chǎn)量分別為空白組的1.57、1.72、1.43和1.81倍。經(jīng)Duncan檢測得知，濃度為0.25%的YG71和YY26對懸浮細(xì)胞α-松油醇的積累影響無顯著性差異，其促進(jìn)作用相當(dāng)且最強(qiáng)(表3)。

從圖2可見，0.25%YG71試驗(yàn)組色譜圖中，在2～3 min及8～14 min范圍內(nèi)所出面積和峰數(shù)量與對照組相比有明顯的增加，出現(xiàn)了一些空白組中沒有的峰，證明誘導(dǎo)子除誘導(dǎo)增加了所測的1,8-桉葉油素、 α-松油醇和γ-松油烯產(chǎn)量外， 還誘導(dǎo)了其他代謝產(chǎn)物的增加與新的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。

表 2　內(nèi)生真菌處理后懸浮細(xì)胞中總揮發(fā)性代謝產(chǎn)物積累量 (總峰面積/pAs)

注： 總峰面積=樣品總峰面積-空白總峰面積。下表同。

Note: Total peak area = Sample total peak area-control total peak area. The same below.

圖 2　 0.25%YG71處理懸浮細(xì)胞后揮發(fā)性物質(zhì)積累的色譜圖　A. 樣品； B. 空白。Fig. 2　Chromatograms for the accumulation of volatile substances in suspension cells after processed by 0.25% YG71　A. Sample； B. Control.

3　討論與結(jié)論

本研究中，從油樟根和葉中分離得到的4種內(nèi)生真菌加入懸浮細(xì)胞后，細(xì)胞生物量普遍受到抑制，而對總揮發(fā)性代謝產(chǎn)物及3種萜類物質(zhì)積累影響的總體趨勢是在低濃度下有促進(jìn)作用。這與細(xì)胞生長分裂能力下降時(shí)，次生代謝物產(chǎn)量高，及細(xì)胞生長分裂能力旺盛時(shí)，次生代謝物產(chǎn)量低的普遍規(guī)律(李浚明和朱登云，2005)吻合。雖然內(nèi)生真菌對懸浮細(xì)胞生長有一定的抑制作用，但可嘗試通過改變添加真菌發(fā)酵液的時(shí)間等因素來克服這一問題(游玲等,2009)，有待進(jìn)一步研究。本研究中，4種內(nèi)生真菌對油樟懸浮細(xì)胞生長的抑制作用隨著濃度的增加其抑制作用越強(qiáng)。這表明真菌代謝物中可能含有某些會(huì)影響細(xì)胞生長的有毒物質(zhì)，或者是誘導(dǎo)過程中細(xì)胞本身產(chǎn)生了一些對自身有毒的物質(zhì)(Lan et al,2003)。具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

本研究中，4種內(nèi)生真菌中，無論是來自油樟葉的內(nèi)生真菌YY11和YY26還是來自油樟根的內(nèi)生真菌YG71和YG42都在不同程度上促進(jìn)了揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的積累。誘導(dǎo)作用最強(qiáng)的真生真菌YG71是來自于根的，而誘導(dǎo)的對象1,8-桉葉油素主要存在于葉(55.58%)中。說明內(nèi)生真菌影響宿主細(xì)胞揮發(fā)性代謝產(chǎn)物，特別是萜類物質(zhì)的積累，無器官特異性或無明顯的器官關(guān)聯(lián)性。這可能與內(nèi)生真菌在宿主體內(nèi)的定殖與擴(kuò)散有關(guān)。

表 3　內(nèi)生真菌處理后懸浮細(xì)胞中3種萜類化合物積累量 (峰面積/pAs)

本研究中，內(nèi)生真菌對3種揮發(fā)性萜類積累的促進(jìn)作用最大的產(chǎn)物是油樟油主成分1,8-桉葉油素，高于空白10倍。這在一定程度上解釋了游玲(2009)等推測的宜賓產(chǎn)油樟油1,8-桉葉油素的含量高于江西等地產(chǎn)的原因是與宜賓獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境導(dǎo)致的特殊內(nèi)生菌微環(huán)境有關(guān)系，但YG71是否是宜賓油樟特有的內(nèi)生真菌還有待于進(jìn)一步研究。

Expósito et al(2009)研究表明外源紫杉醇誘導(dǎo)子對紫杉醇相關(guān)基因的表達(dá)存在調(diào)控作用。本研究所用內(nèi)生真菌中可能含有與所測物質(zhì)相同或類似物的外源物質(zhì)(游玲等，2009)，這些物質(zhì)在對油樟細(xì)胞的誘導(dǎo)過程中起到一定的作用，但是怎樣影響相關(guān)基因的表達(dá)，還有待進(jìn)一步針對內(nèi)生菌作用下這些代謝產(chǎn)物的mRNA水平和蛋白質(zhì)水平分子響應(yīng)情況及基因組和蛋白質(zhì)組解釋研究。

本研究因?yàn)槭軜?biāo)品限制，僅檢測了目前開發(fā)利用價(jià)值較高的、有標(biāo)品的3種萜類物質(zhì)。內(nèi)生真菌YG71還可以誘導(dǎo)其它代謝產(chǎn)物的增加或新的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。這些物質(zhì)有待于進(jìn)一步的鑒定。這說明內(nèi)生真菌對宿主細(xì)胞代謝影響是通過多代謝途徑實(shí)現(xiàn)的，并影響多種物質(zhì)的生物合成。

由于本研究中所加發(fā)酵液含有與所測產(chǎn)物相同或相似的揮發(fā)性物質(zhì)，在表示產(chǎn)物的積累時(shí)減去了誘導(dǎo)子原本含有的部分，因此部分產(chǎn)物積累量為負(fù)值。負(fù)值意味著懸浮細(xì)胞揮發(fā)性物質(zhì)積累量少于添加的真菌發(fā)酵液中所含揮發(fā)性物質(zhì)。負(fù)值主要是在高濃度(10%)真菌發(fā)酵液條件下出現(xiàn)的。這說明高濃度的內(nèi)生真菌發(fā)酵液抑制了懸浮細(xì)胞揮發(fā)性物質(zhì)的產(chǎn)生。這可能與內(nèi)生菌和宿主細(xì)胞之間有共代謝途徑，內(nèi)生真菌參與了油樟油的形成過程并有共同代謝產(chǎn)物有關(guān)(游玲等，2009)。這樣的結(jié)果可能導(dǎo)致懸浮體系中添加的多量誘導(dǎo)子促進(jìn)了懸浮細(xì)胞生成物增加，使懸浮細(xì)胞代謝反應(yīng)向減少生成物質(zhì)方向進(jìn)行，也許生成了其它不揮發(fā)性或者揮發(fā)性差的物質(zhì)，擅長檢測揮發(fā)性物質(zhì)的GC-MS未能檢測到。這還有待于進(jìn)一步研究。

內(nèi)生真菌在體外進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，菌的生長代謝狀況會(huì)與其在體內(nèi)有較大差異，再加上揮發(fā)性物質(zhì)產(chǎn)生后在培養(yǎng)、破碎、滅菌等過程中有不少的揮發(fā)損失。因此，真正加入到培養(yǎng)基中起作用的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的種類和數(shù)量會(huì)少于在內(nèi)環(huán)境中實(shí)際的代謝產(chǎn)物，所以，此結(jié)果只能在一定程度上反映內(nèi)生真菌對宿主細(xì)胞生長和代謝產(chǎn)物積累的作用。但本研究結(jié)果對于世界需求量很大的油樟來源的左旋1,8-桉葉油素(其它植物源1,8-桉葉油素是右旋)生產(chǎn)有指導(dǎo)意義，如通過強(qiáng)化接種、澆灌菌種發(fā)酵液等形式進(jìn)行提高代謝產(chǎn)物措施的菌種選擇有指導(dǎo)意義，對充實(shí)內(nèi)生菌影響香料植物萜類物質(zhì)等揮發(fā)性代謝產(chǎn)物合成理論有積極意義。

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Effects of fungal endophytes on cell suspension culture ofCinnamomumlongepaniculatum

WEI Qin1, TAN Yun-Ya2, LI Qun2*, YOU Ling1, WANG Chao2, WANG Yu1, LIAO Lin1

( 1.KeyLabofAromaticPlantResourcesExploitationandUtilizationinSichuanHigherEducation,YibinUniversity,Yibin 644000, China; 2.CollegeofLifeSciences，SichuanNormalUniversity， Chengdu 610101， China )

We studied the effects of fungal endophytes YG42, YG72, YY11 and YY26 on cell growth and volatile of secondary metabolites accumulation in suspension cultures ofCinnamomumlongepaniculatum. The results showed that four kinds of fungal endophytes had obvious inhibitory effects onC.longepaniculatumcell growth, and the denser the fermentation fluid was, the stronger inhibitory effects they had. The trend of the effects that the four kinds of endophytic fungi had on the total volatile of secondary metabolites accumulation andC.longepaniculatumoil component 1,8-cineole γ-terpinene andα-terpineol accumulation in suspension cultures ofC.longepaniculatumwas promoted at a low concentration and inhibition at a high concentration. The promotion effects of 1% YG42, YY26 and 0.25% YY11 on the total volatile of secondary metabolites accumulation were equivalent, and they had the strongest promoting effects on the total volatile of secondary metabolites accumulation, which were 2.00, 1.95 and 2.01 times of the control respectively. The 0.25% YG71 had the strongest promoting effects on the 1,8-cineole accumulation, which was 11.03 times of the control. The 0.25% YG71 and YY26 had the strongest promoting effects on thea-terpineol accumulation, which were 1.72 and 1.81 times of the control respectively. γ-terpinene was not detected in the control. Four kinds of endophytic fungi could induce γ-terpinene production, the biggest peak areas were 0.19， and the endophytic fungi was 0.25% YG71. This research will enrich the theory that fungal endophytes affect the volatile of secondary metabolites in aromatic plant, and provide experimental evidence for the use of endophytic fungi to increase the amount of useful component inC.longepaniculatumoil accumulation in production.

fungal endophytes, volatile of secondary metabolites, suspension culture, 1,8-cineole, γ-terpinene, α-terpineol

10.11931/guihaia.gxzw201501023魏琴, 譚韻雅, 李群， 等. 內(nèi)生真菌對油樟懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的影響[J]. 廣西植物， 2016， 36(8):923-929WEI Q, TAN YY, LI Q， et al. Effects of fungal endophytes on cell suspension culture ofCinnamomumlongepaniculatum[J]. Guihaia， 2016， 36(8):923-929

2015-01-19

2015-03-03

四川省教育廳項(xiàng)目(08ZA002)；四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2010JY0093)；宜賓市科技局項(xiàng)目(2011ZSF008)；四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(2012KFZ001)[Supported by Sichuan Program of Education Office(08ZA002)； Sichuan Planning Program of Science and Technology(2010JY0093)； Yibin City Program of Science and Technology Bureau(2011ZSF008)； Key Laboratory of Sichuan Colleges and Universities(2012KFZ001)]。

魏琴(1967-)，女，四川屏山人，博士，教授，主要從事資源植物學(xué)研究，(E-mail)weiqin2001-67@163.com。

李群, 博士，副教授，主要從事植物組織培養(yǎng)研究，(E-mail)liqun01234@163.com。

Q943.1

A

1000-3142(2016)08-0923-07