姜慧明，楊　紅，呂國(guó)忠，孫曉東，滕　聰

(大連民族大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，遼寧 大連 116605)

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響應(yīng)面分析法優(yōu)化蛹蟲(chóng)草菌糠多糖提取工藝的研究

姜慧明，楊紅，呂國(guó)忠，孫曉東，滕聰

(大連民族大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，遼寧 大連 116605)

以蛹蟲(chóng)草(Cordycepsmilitaris)菌糠為材料，進(jìn)行菌糠多糖提取條件的優(yōu)化研究。單因素實(shí)驗(yàn)表明，提取溫度、水料比及提取時(shí)間均不同程度地影響多糖提取率。根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理對(duì)提取溫度、水料比、提取時(shí)間進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用響應(yīng)面軟件Design-Expert進(jìn)行處理，獲得蛹蟲(chóng)草菌糠多糖提取最佳的優(yōu)化條件。即提取溫度100 ℃，水料比50∶1，提取時(shí)間3 h 優(yōu)化條件下多糖提取率達(dá)5.45 %, 多糖提取預(yù)測(cè)值為5.88 mg·mL-1。建立的模型擬合度較好，可用來(lái)對(duì)蛹蟲(chóng)草多糖提取工藝的分析和預(yù)測(cè)。

蛹蟲(chóng)草(Cordycepsmilitaris)；菌糠；多糖；響應(yīng)面分析

蛹蟲(chóng)草(Cordycepsmilitaris(L) Link.)球殼目、麥角菌科、蟲(chóng)草屬。蛹蟲(chóng)草多糖具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖等多種生物活性功能[1]。菌糠是食用菌栽培收貨后的培養(yǎng)基剩余物，其中含有豐富的氨基酸、菌類多糖、Fe、Ca 、Zn、Mg等微量元素及一些食用菌生長(zhǎng)的代謝產(chǎn)物，是一種可再生利用的生物資源。近年來(lái)，對(duì)菌糠的利用已經(jīng)開(kāi)展了一些有益的探索。如Zhu[2]等從食用菌中篩選抗細(xì)菌物質(zhì)；Williams等[3]利用菌糠發(fā)酵制備燃料沼氣；Sochtig等[4-6]利用菌糠加工有機(jī)肥用于園藝和食用菌的生產(chǎn)；劉兆偉等[7]成功地利用菌糠生物降解有害物質(zhì)，借助改性食用菌菌糠吸附重金屬離子，以食用菌菌糠為原料聚合合成多種菌糠基復(fù)合高吸水樹(shù)脂[8]等。從廢棄菌糠中提取多糖已成為食用菌菌糠的再次開(kāi)發(fā)與利用的研究熱點(diǎn)之一。

本研究選用以大米為主要基質(zhì)的蛹蟲(chóng)草菌糠(主要成分大米81.2 %、蠶蛹粉1.8 %、黃豆9.7 %，白糖5.4 %、KH2PO40.8 %、MgSO40.8 %、VB10.3 %)為材料，利用水提法提取蛹蟲(chóng)草菌糠多糖，并對(duì)不同條件下提取的多糖含量進(jìn)行測(cè)定比較。

1　材料與方法

1.1材料

蛹蟲(chóng)草菌糠采集于大連普蘭店謝屯蛹蟲(chóng)草種植地。

1.2儀器及試劑

RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海研承儀器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；Sorvall Evolution RC高速落地離心機(jī)(賽默飛世爾科技); UV 2100紫外可見(jiàn)分光分度計(jì)(河南兄弟儀器設(shè)備有限公司); DH27-9053A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒); HH-S21-6-S水浴鍋(上海市百典儀器廠);PL303電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多); 80目標(biāo)準(zhǔn)篩。

主要試劑為氯仿、三氯甲烷、茚三酮、濃硫酸、蒽酮、正丁醇、葡萄糖、碘液。

1.3方法

1.3.1原料預(yù)處理

將蛹蟲(chóng)草菌糠用木槌打碎至黃豆粒大小，放入鼓風(fēng)干燥箱中干燥，在50 ℃的條件下烘干至恒重。粉碎機(jī)粉碎后再過(guò)80目篩，樣品存放至干燥處備用。

1.3.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將100 mg 葡萄糖置于100 mL 容量瓶中，加水至刻度，分別吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，以去離子水補(bǔ)至2.0 mL。稱取0.1 g蒽酮至燒杯中，加入80 %濃H2SO4100 mL溶解，搖勻，備用。每只試管中加入蒽酮-濃硫酸試劑6 mL，混勻，靜置冷卻至室溫，沸水浴加熱15 min，迅速置于冰水中冷卻15 min。以空白為對(duì)照，在625 nm下測(cè)吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3蛹蟲(chóng)草多糖提取條件的優(yōu)化

在不同提取溫度、時(shí)間和水料比處理?xiàng)l件下浸提后，離心獲上清液。將上清液稀釋20倍，取1 mL，加入3 mL蒽酮濃硫酸試劑搖勻，靜置20 min后，在625 nm下測(cè)不同處理?xiàng)l件下的吸光值。

1.3.4蛹蟲(chóng)草多糖的純化

利用Sevage 法[1]對(duì)每份多糖溶液做5次去蛋白處理,留上層溶液備用。

加蒸餾水溶解優(yōu)化條件下獲得的多糖,經(jīng)5次去蛋白處理后,向獲得的上層溶液中加入4倍體積的95 %乙醇，經(jīng)醇析過(guò)夜沉淀處理獲得多糖；再依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚分別洗滌2次，室溫下干燥后獲得純化的蟲(chóng)草粗多糖，稱重后計(jì)算多糖分離率。

蛋白質(zhì)檢測(cè)方法采用茚三酮法。具體方法：取待檢的多糖溶液1 mL，向其中滴加2～3 滴茚三酮溶液，觀察是否有藍(lán)色出現(xiàn)[6]。

1.3.5單因素實(shí)驗(yàn)

提取時(shí)間:稱取10 g蛹蟲(chóng)草菌糠放入250 mL三角瓶中，加去離子水200 mL，搖勻后分別在100 ℃水浴加熱2，3，4，5，6 h，冷卻，6 000 r·min-1離心10 min，獲上清液，稀釋20倍后量取1 mL，再加入蒽酮濃硫酸試劑3 mL，搖勻，室溫下放置20 min，在625 nm下測(cè)吸光值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線得多糖含量。

水料比：稱取蛹蟲(chóng)草菌糠5 g，分別按照10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1水料比(mL·g-1,下同)加去離子水，搖勻后在100 ℃水浴鍋中加熱4 h，測(cè)多糖含量。

提取溫度：稱取10 g蛹蟲(chóng)草菌糠放入250 mL三角瓶中，加入去離子水2 000 mL，搖勻，分別在40，50，60，70，80，90，100 ℃條件下水浴4 h，測(cè)多糖含量。

1.3.6正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，結(jié)合三個(gè)單因素水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別對(duì)多糖提取有顯著影響的溫度、水料比、時(shí)間的三水平三因素響應(yīng)面分析方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。因素與水平見(jiàn)表1。

表1　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素及水平

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1提取溫度對(duì)多糖含量的影響

提取溫度與多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的關(guān)系如圖1。由圖1可知，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著提取溫度的升高而呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)提取溫度升至100 ℃時(shí)，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最高，并趨于平緩。

圖1　提取溫度與多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的關(guān)系

2.1.2提取時(shí)間對(duì)多糖含量的影響

提取時(shí)間與多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的關(guān)系如圖2。由圖2可知，依據(jù)2.1.1的結(jié)果，100 ℃下提取多糖，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，呈現(xiàn)先高后低的趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到4 h 時(shí)，多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最高。

圖2　提取時(shí)間與多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的關(guān)系

2.1.3水料比對(duì)多糖含量的影響

水料比與多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的關(guān)系如圖3。由圖3可知，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著水比例的增加，呈現(xiàn)先高后低的趨勢(shì)，當(dāng)水料比為40∶1 時(shí)多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最高。

圖3　水料比與多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的關(guān)系

2.2響應(yīng)面試驗(yàn)分析

2.2.1響應(yīng)面分析蛹蟲(chóng)草多糖提取方案與結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)法以及溫度、水料比、時(shí)間的三水平三因素進(jìn)行了響應(yīng)面分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　響應(yīng)面分析蛹蟲(chóng)草菌糠多糖提取工藝方案及結(jié)果

2.2.2蛹蟲(chóng)草多糖提取回歸方程的建立及試驗(yàn)分析

表3　響應(yīng)面二次模型及其回歸系數(shù)的方差分析結(jié)果

2.2.3響應(yīng)曲面和等高線分析

響應(yīng)面是根據(jù)回歸方程繪制的呈現(xiàn)各試驗(yàn)因素相互作用關(guān)系的三維空間曲面，可以檢驗(yàn)變量的響應(yīng)值大小,明確變量的相互關(guān)系。根據(jù)等高線圖和響應(yīng)面，觀察擬合響應(yīng)面的形狀及特點(diǎn)，分析提取時(shí)間、溫度和水料比對(duì)多糖提取率的影響如圖4、圖5、圖6。

等高線圖可以較直觀地反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，方便分析各參數(shù)之間的相互作用。由圖4可以看出，提取時(shí)間和提取溫度交互作用不明顯，等高線沿著X2方向(提取時(shí)間)變化較快，而沿X1方向(提取溫度)變化不明顯，在試驗(yàn)水平下，提取時(shí)間較提取溫度對(duì)響應(yīng)值的影響顯著。在提取溫度和水料比的交互作用中，提取溫度(X1)對(duì)響應(yīng)值的影響比水料比(X3)顯著(如圖5)。由圖6可以看出，提取時(shí)間與水料比交互作用也不顯著，表現(xiàn)為曲線平滑，在試驗(yàn)水平下，提取時(shí)間和水料比對(duì)響應(yīng)值的影響差異不大。

圖4　提取時(shí)間和提取溫度交互作用的響應(yīng)面和等高線

圖5　提取溫度和水料比交互作用的響應(yīng)面和等高線

圖6　提取時(shí)間和水料比交互作用的響應(yīng)面和等

3　結(jié)　論

通過(guò)對(duì)蛹蟲(chóng)草菌糠多糖提取時(shí)間、提取溫度、水料比三個(gè)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并且針對(duì)這三個(gè)因素水平的響應(yīng)面進(jìn)行分析，得到優(yōu)化的蛹蟲(chóng)草菌糠多糖的最佳提取工藝為100 ℃， 3 h， 50∶1，此時(shí)多糖提取預(yù)測(cè)值為5.88 mg·mL-1。該優(yōu)化工藝對(duì)蛹蟲(chóng)草菌糠多糖提取具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

[1] XIAO J H, ZHONG J J. Secondary metabolites fromCyrodycepsspecies and their antitum or activity studies [J]. Recent Pat Biotechnol, 2007,1:123-137.

[2] ZHU HJ, SHENG K, YAN E, et al. Extraction, purify cation and antibacterial activities of a polysaccharide from spent mushroom substrate [J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2012, 50(3): 840-843.

[3] WILLIAMS B C, MCMULLAN J T, MCCAHEY S. An initial assessment of spent mushroom compost as a potential energy feedstock [J]. Biores Technol, 2001,79:227-230.

[4] SOCHTIG H, GRABBE K. The production and utilization of organic mineral fertilizer from spent mushroom compost [M]. Rotterdam (TheNetherlands): Balkema Publishers, 1995: 907-915.

[5] STEWART D P C, CAMERON K C, CORMFORTH I S. Release of sulphate potassium, calcium and magnesium from spent ushroom compost under laboratory conditions [J]. Biol Fertil Soils, 1998, 26: 146-151.

[6] LEOPOLD M，NYOCHEMBENG，CAULA A B, et al. Optimizing edible fungal growth and biodegradation of inedible crop residues using various cropping methods[J]. Bioresource Technology, 2008, 99:5645-5649.

[7] 劉兆偉, 王凱, 張曉娣, 等. 改性食用菌菌糠對(duì)重金屬離子的吸附特性研究[J]. 科技視界, 2013 (16): 19-20.

[8] 程志強(qiáng). 菌糠基復(fù)合高吸水樹(shù)脂的制備及性能研究[D]. 長(zhǎng)春：吉林大學(xué)化工學(xué)院, 2013.

(責(zé)任編輯鄒永紅)

Extraction Optimizing of Polysaccharide from Waste Materials ofCordycepsmilitarisby Response Surface Analysis Method

JIANG Hui-ming, YANG Hong, LV Guo-zhong, SUN Xiao-dong, TENG Cong

(School of Environment and Resources, Dalian Minzu University, Dalian Liaoning 116605, China)

Single-factor experiments and Box-Behnken central composite design were used to optimize the extraction of polysaccharides from waste materials ofCordycepsmilitaris. The single-factor experiment results showed that three factors including the extraction time, water-materials ratio, and extraction temperature of the experiment would affect the extraction degree. According to Box-Behnken central composite design principle, three factors and three levels experiments are designed, and optimal conditions of extraction of polysaccharides are obtained. Response surface processing software Design-Expert was used. Results showed that optimal extraction conditions were temperature of 100 ℃, time of 3 h, water-material ratio of 50∶1. The extraction rate of polysaccharide was 5.45 % and predictive value of polysaccharide was 5.88 mg/mL. The model fit well, which can be used to analyze and predict the extraction process of polysaccharide fromCordycepsmilitaris.

Cordycepsmilitaris; waste material; polysaccharide; response surface analysis

2096-1383(2016)05-0462-04

2016-07-07；最后

2016-07-25

姜慧明(1972-)，男，山東萊陽(yáng)人，副教授，博士，主要從事化學(xué)研究。

楊紅(1978-)，女，遼寧海城人，副教授，博士，主要從事食用菌研究，E-mail：yanghong@dlnu.edu.cn。

S646

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