孫　強(qiáng)，邱　峰,趙軍方，方　政，李新明，孫明磊

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科，河南 鄭州 450052；2.河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052)

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全反式維甲酸聯(lián)合順鉑在誘導(dǎo)人頭頸癌TCA8113細(xì)胞凋亡中的作用

孫強(qiáng)1,2，邱峰1,趙軍方1，方政1，李新明1，孫明磊1

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科，河南 鄭州 450052；2.河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052)

目的研究全反式維甲酸(ATRA)與順鉑對人頭頸癌TCA8113細(xì)胞凋亡的影響。方法ATRA和順鉑單獨(dú)及聯(lián)合作用于TCA8113細(xì)胞，采用MTT法檢測細(xì)胞生長，并觀察細(xì)胞形態(tài)變化；使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及凋亡；通過western blot實(shí)驗(yàn)檢測caspase-3表達(dá)情況。結(jié)果ATRA作用于TCA8113細(xì)胞后，細(xì)胞生長明顯受到抑制，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞凋亡比例明顯增加，caspase-3蛋白表達(dá)下調(diào)，ATRA與順鉑聯(lián)合作用于腫瘤細(xì)胞后，其抑癌作用加強(qiáng)。結(jié)論ATRA聯(lián)合順鉑對人頭頸癌TCA8113細(xì)胞具有協(xié)同抑癌作用。

TCA8113細(xì)胞；全反式維甲酸；順鉑；細(xì)胞凋亡

[Abstract]ObjectiveTo observe the effect of all-trans retinoic acid (ATRA) and cisplatin on the proliferation of human head and neck cancer TCA8113 cells.MethodsTCA8113 cells were treated with ATRA and (or) cisplatin respectively.Cell proliferation was detected by the method of MTT.Cell cycle was detected by flow cytometry.ResultsThe growth of the cells treated with ATRA was inhibited obviously and the morphology of the cells were changed.The apoptosis rate of TCA8113 cells was increased gradually and the effect was enhanced when combined ATRA with cisplatin.ConclusionATRA could inhibit the proliferation of human head and neck cancer TCA8113 cells and the inhibitory effect was synergistic when ATRA combined with cisplatin.

[Key words]TCA8113 cells; all-trans retinoic acid; cisplatin; cell apoptosis

頭頸部中最常見的惡性腫瘤病理類型為鱗癌，約占成人病例數(shù)的90%[1]。頭頸部惡性腫瘤的發(fā)生率較高，位居全身惡性腫瘤的第6位，化療目前仍是提高惡性腫瘤生存率和生活質(zhì)量最有效的方法，因此尋找針對惡性腫瘤特異性的低毒、高效藥物是重要的研究方向。全反式維甲酸全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)最初用于急性早幼粒細(xì)胞白血病的治療，近年來已有報道其在實(shí)體瘤治療方面作用明顯。順鉑是鉑類抗腫瘤化合物，是臨床常用化療藥物。根據(jù)2種藥物的不同作用機(jī)制，其聯(lián)合用藥于頭頸鱗癌是否能夠起到協(xié)同抑癌作用，目前尚未見明確報道。本研究旨在研究ATRA與順鉑聯(lián)合應(yīng)用于人頭頸癌TCA8113細(xì)胞的協(xié)同抑癌作用。

1　材料與方法

1.1材料順鉑(南京制藥廠有限公司)用去離子水配制成1 mg·mL-1溶液，過濾除菌，4 ℃冷藏貯存。ATRA(美國Sigma公司)避光下用無水乙醇配制成10-2mol·L-1，過濾除菌，-20 ℃冰箱避光貯存?zhèn)溆?。MTT(美國Sigma公司)用PBS液配制成5 mg·mL-1，過濾除菌，4 ℃冰箱貯存?zhèn)溆?。TCA8113細(xì)胞由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院提供。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2MTT檢測分為4組：對照組(1 mL·L-1的無水乙醇)、ATRA組(10-5mol·L-1)、順鉑組(70 mg·L-1)和聯(lián)合組(ATRA終濃度為10-5mol·L-1，順鉑終濃度為70 mg·L-1)。用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，以5 000個/孔接種于96孔板，每組細(xì)胞設(shè)4個復(fù)孔。連續(xù)培養(yǎng)6 d，每隔24 h去除上清，加入20 μL 5.0 mg·mL-1濃度的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去上清，加入200 μL二甲基亞砜。震蕩10 min，酶聯(lián)免疫標(biāo)記儀設(shè)定波長為490 nm，檢測各孔光密度(OD)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測收集細(xì)胞1×106·mL-1，預(yù)冷PBS洗2次。用PBS稀釋乙醇至70%濃度，加入1 mL，4 ℃過夜固定。PBS洗1次，棄盡液相。加入400 μL PI/RNase Staining Buffer,避光孵育15 min。流式細(xì)胞儀檢測，使用488 nm激發(fā)光，Cellquest軟件收細(xì)胞至10 000個，ModFitLT軟件分析細(xì)胞周期。

1.2.4Western blot檢測收獲指數(shù)生長期細(xì)胞的蛋白，測定蛋白濃度。配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%分離膠聚丙烯酰胺凝膠，轉(zhuǎn)膜使用電流300 mA，2 h，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉封閉4 ℃過夜，D2-40和β-actin一抗在搖床孵育4 h。二抗孵育1 h，化學(xué)發(fā)光Western blot分析試劑盒：ECL Plus Western blot檢測試劑盒(英國Amersham公司),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化顯微鏡下觀察可見24 h時對照組腫瘤細(xì)胞生長良好，呈多邊形，胞體透亮；ATRA作用組細(xì)胞在24 h時細(xì)胞攣縮成圓形，胞內(nèi)顆粒增多；48 h時，實(shí)驗(yàn)組大量細(xì)胞呈圓形懸浮狀態(tài)，少量細(xì)胞貼壁生長，部分細(xì)胞斷裂成碎片；72 h時，實(shí)驗(yàn)組大量細(xì)胞呈漂浮狀態(tài)，大量細(xì)胞裂解并碎片形成。

2.2順鉑、ATRA對TCA8113細(xì)胞的生長抑制作用MTT法測定細(xì)胞增殖活性：ATRA可以抑制TCA8113細(xì)胞增殖活性，在48 h時抑制最為明顯；與順鉑聯(lián)用后增殖活性明顯降低(P<0.05)。到第6天，細(xì)胞生長進(jìn)入平臺期。見圖1。

圖1　ATRA及順鉑對TCA8113細(xì)胞增殖活性的抑制作用

2.3ATRA及順鉑對TCA8113細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞儀檢測顯示： 對照組細(xì)胞處于G2/M期比例明顯高于藥物處理組；藥物聯(lián)用后出現(xiàn)G0/G1期和G2/M期阻滯，明顯促進(jìn)TCA8113細(xì)胞凋亡(P<0.05)。見表1。

2.4ATRA及順鉑作用于TCA8113細(xì)胞后對細(xì)胞凋亡蛋白caspase-3表達(dá)的影響Western blot實(shí)驗(yàn)顯示ATRA及聯(lián)合用藥作用于細(xì)胞后可見caspase-3總蛋白明顯減少，說明處于功能激活狀態(tài)的caspase-3剪切體增多，進(jìn)而說明ATRA及聯(lián)合用藥組抑癌作用的機(jī)制是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。見圖2。

圖2　ATRA及順鉑對TCA8113細(xì)胞caspase-3表達(dá)的影響

組別G0/G1SG2/M細(xì)胞凋亡率/%對照組45.37±1.9848.41±3.146.22±1.666.77±1.27ATRA組54.44±2.6933.31±3.461)12.25±2.0119.50±2.041)順鉑組40.31±0.7636.80±1.751)22.89±1.761)23.43±3.221)聯(lián)合組48.78±2.481)3)32.75±1.641)3)18.47±2.221)2)33.78±2.211)2)3)

注：與對照組比較，1)P<0.05；與ATRA組比較，2)P<0.05；與順鉑組比較，3)P<0.05。

3　討論

文獻(xiàn)報道很多抗腫瘤藥物是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來發(fā)揮作用的，ATRA是一種的分化誘導(dǎo)劑，在腫瘤細(xì)胞生長、分化中發(fā)揮重要作用，研究提示其能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，在多種惡性腫瘤如白血病、甲狀腺癌、肝癌、大腸癌等起到重要抗腫瘤作用[2-7]。增殖活性是細(xì)胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一，本結(jié)果提示ATRA組的增殖活性抑制在48 h和72 h較對照組明顯增強(qiáng)，說明ATRA對TCA8113細(xì)胞有明顯增殖活性抑制作用。在本實(shí)驗(yàn)中觀察到藥物聯(lián)合組的抑制率與單藥相比，72 h時協(xié)同抑制增殖活性明顯，這表明ATRA與順鉑聯(lián)合用藥具有協(xié)同抑癌作用。

細(xì)胞周期的調(diào)控在腫瘤的發(fā)生中有著重要的作用[4]，細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)節(jié)失控對腫瘤生物學(xué)行為有著重要的影響，研究表明ATRA對腫瘤細(xì)胞可以產(chǎn)生G1期阻滯[8]，而高濃度的順鉑可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)G2/M期阻滯[9]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)ATRA作用于TCA8113細(xì)胞后,G0/G1期的細(xì)胞比增加，S期的腫瘤細(xì)胞比率下降,而ATRA聯(lián)合順鉑用藥作用于TCA8113細(xì)胞后G0/G1期和G2/M期腫瘤細(xì)胞比率均增加，說明聯(lián)合用藥后TCA8113細(xì)胞DNA合成和有絲分裂受阻。單一用藥作用于TCA8113細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)各組的凋亡率與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，聯(lián)合用藥與ATRA組、順鉑組相比，凋亡率明顯提高。

本研究對用藥后凋亡率提高的機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究，caspase-3的激活通常被作為細(xì)胞凋亡的一個重要指標(biāo)，其是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵的執(zhí)行分子[10]。Caspase-3的激活需要從沒有活性的全長(85 000)被剪切成具有活性亞基。本實(shí)驗(yàn)中通過檢測發(fā)現(xiàn)，ATRA及聯(lián)合組作用于腫瘤細(xì)胞后caspase-3全長表達(dá)量明顯下降，說明了caspase-3功能亞基的增多，證實(shí)了ATRA及聯(lián)合組通過誘導(dǎo)TCA8113細(xì)胞的凋亡是其發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制之一。

本實(shí)驗(yàn)說明ATRA能調(diào)節(jié)人頭頸鱗癌TCA8113細(xì)胞周期，并發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，與順鉑聯(lián)合用藥后可協(xié)同發(fā)揮誘導(dǎo)人頭頸鱗癌TCA8113細(xì)胞的凋亡。這為今后腫瘤化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用提供里理論依據(jù)。

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Effect of All-trans Retinoic Acid Compared with Cisplatin in Inducing Apoptosis of TCA8113 Cell Lines

Sun Qiang1,2,Qiu Feng1,Zhao Junfang1,Fang Zheng1,Li Xinming1,Sun Minglei1

(1.DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China;2.InstituteofClinicalMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號：81402231)；河南省科技廳基礎(chǔ)研究和前沿技術(shù)研究項(xiàng)目(編號：142300410315)；鄭州市口腔頜面外科院士工作站資助項(xiàng)目(編號：152PYSGZ040)；鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)青年基金項(xiàng)目

孫強(qiáng)(1985-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事口腔頜面外科基礎(chǔ)與臨床工作。E-mail：85244275@qq.com

孫明磊(1973-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要從事口腔頜面外科基礎(chǔ)與臨床工作。E-mail：sunmlsuccess@sina.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2016.04.002

R739.8；R730.23

A

1673-5412(2016)04-0281-03

2016-07-23)