徐偉銘，楊佩濃，袁秋琦

細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)與BRAF基因突變對甲狀腺結(jié)節(jié)的診斷價值

徐偉銘，楊佩濃，袁秋琦

目的探討細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)（FNAC）與B型有絲分裂原激活的蛋白激酶依賴性激酶的激酶（BRAF）基因突變聯(lián)合檢測對鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的應(yīng)用價值。方法回顧性分析收治的疑似惡性病變并手術(shù)治療的甲狀腺結(jié)節(jié)患者103例，術(shù)前均行FNAC及BRAF基因突變檢測，以術(shù)后病理為“金標(biāo)準(zhǔn)”，計算其診斷價值。結(jié)果FNAC單獨診斷甲狀腺癌的靈敏度為73.8%，特異度為93.4%，漏診率為26.2%，誤診率為6.6%，陽性預(yù)測值為88.6%，陰性預(yù)測值為85.4%，診斷符合率為83.8%；聯(lián)合BRAF基因突變后，靈敏度為90.5%，特異度為98.4%，漏診率為9.5%，誤診率為1.6%，陽性預(yù)測值為97.4%，陰性預(yù)測值為93.8%，診斷符合率為93.8%。結(jié)論FNAC與BRAF基因突變聯(lián)合檢測鑒別甲狀腺疾病良惡性結(jié)果可靠，具有一定的推廣價值。

甲狀腺結(jié)節(jié)；細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)；BRAF基因突變

目前，我國甲狀腺結(jié)節(jié)的檢出率呈逐年升高趨勢，惡性病變占 5.0%～15.0%。據(jù)悉，超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查（FNAC）是目前鑒定其良惡性的最可靠手段之一[1]。然而，由于FNAC取樣量少，不能反映病灶組織的全貌，尤其是對轉(zhuǎn)移灶的判斷，存在較大的局限性，漏診率偏高。近年，分子病理診斷技術(shù)的發(fā)展為腫瘤性疾病的早期診斷提供了新希望。諸多研究證實，B型有絲分裂原激活的蛋白激酶依賴性激酶的激酶（BRAF）基因突變與甲狀腺癌變密切相關(guān)，是甲狀腺癌的潛力標(biāo)記物[2]。本研究采用FNAC與BRAF基因突變聯(lián)合檢測的方案鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性，發(fā)現(xiàn)其具有較高應(yīng)用價值?，F(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料收集2013年12月至2015年12月浙江省臺州醫(yī)院收治的疑似惡性病變的103例甲狀腺結(jié)節(jié)患者，其中男41例，女62例；年齡9～73歲，平均（38.2±9.3）歲；結(jié)節(jié)直徑0.4～4.9 cm，平均（1.8±0.5）cm。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前超聲、甲狀腺功能、FNAC及BRAF基因突變檢查資料詳細(xì)；（2）接受手術(shù)治療，有明確的術(shù)后病理結(jié)果。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并有其他腫瘤或癌癥；（2）全身炎性疾??；（3）急性感染性疾?。唬?）免疫系統(tǒng)疾?。唬?）基礎(chǔ)合并癥急性期。

1.2檢查方法聯(lián)合檢測時，兩者均為陰性為陰性，其中之一為陽性時即為陽性。

1.2.1FNAC患者仰臥位，頸墊高，頭后仰，充分暴露穿刺部位，確定最佳穿刺點，并標(biāo)記。常規(guī)消毒、鋪巾，利多卡因局部麻醉，超聲引導(dǎo)下負(fù)壓穿剌器穿刺取樣。根據(jù)具體病情調(diào)整深度、增益、聚焦部位，微小鈣化、囊實性結(jié)節(jié)及囊壁為重點樣部位，反復(fù)提插抽吸5次以上。所得樣本送病理科涂片鏡檢，根據(jù)2010年發(fā)布的甲狀腺病理細(xì)胞學(xué)Bethesda報告系統(tǒng)6個診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類。

1.2.2BRAF基因突變檢測超聲引導(dǎo)下負(fù)壓穿剌取樣，采用人類BRAF基因V600E突變檢測試劑盒（上海星科生物科技有限公司）檢測BRAF基因突變位點。在UCSCGenome Bioinformatics檢索BRAF基因序列，設(shè)計引物，上游：5’-TCATAA TGCTTGCTCTGA TAGGA -3’；下游：5’-GGC CAA AAA TTT AAT CAG TGG A-3’，常規(guī)反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行實時PCR實驗，解凍混合液，并與Taq酶、待測DNA樣品以20∶0.25∶5的比例混勻，置入PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95℃、5min；（95℃、25s，62℃、20s，72℃、20 s）15個循環(huán)；（93℃、25s，58℃、35s，72℃、20 s）31個循環(huán)。于58℃時收集FAM和HEX信號。樣本Ct≥28為陰性，樣本Ct＜28為陽性。

1.3觀察指標(biāo)靈敏度=a（/a+c）×100%，特異度=d（/b+d）×100%，漏診率=c（/a+ c）×100%，誤診率=b（/b+d）×100%，陽性預(yù)測值=a（/a+b）×100%，陰性預(yù)測值=d/ （c+d）×100%，準(zhǔn) 確 度=（a+d）/總 例數(shù)×100%。見表1。

1.4統(tǒng)計方法采用 SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以率表示，采用2檢驗；＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

經(jīng)術(shù)后病理證實，本組病例良性病灶61例，分別為結(jié)節(jié)性甲狀腺腫39例、慢性甲狀腺炎13例、腺瘤9例；惡性病變42例，分別為甲狀腺乳頭狀癌29例、甲狀腺髓樣癌13例。FNAC結(jié)果顯示標(biāo)本無法診斷占5例、良性病變45例、意義不明確的細(xì)胞非典型病變7例、濾泡性腫瘤及可疑濾泡性腫瘤5例、可疑惡性6例、惡性35例。FNAC單獨診斷甲狀腺癌的靈敏度為73.8%，特異度為93.4%，漏診率為 26.2%，誤診率為6.6%，診斷符合率為83.8%；聯(lián)合BRAF基因突變后，靈敏度為90.5%，特異度為98.4%，漏診率為9.5%，誤診率為1.6%，診斷符合率為93.8%；其中靈敏度、漏診率及診斷符合率的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（2≥3.977，均＜0.05）。見表2～3。

3　討論

臨床鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)良、惡性的主要依據(jù)包括結(jié)節(jié)大小、病變范圍、囊實性及功能變化等，多依靠觸診、影像學(xué)掃描及實驗室化驗綜合完成[3]。FNAC又稱細(xì)針抽吸活檢，顧名思義，是使用細(xì)針及針管直接刺入病變區(qū)域進(jìn)行取材，對病灶內(nèi)小部分組織進(jìn)行涂片鏡檢的一種診斷方式，其主要依據(jù)是細(xì)胞形態(tài)學(xué)，結(jié)果比較可靠。據(jù)報道[4-5]，F(xiàn)NAC的敏感性和特異性分別為 68%～ 98%、72%～100%，診斷經(jīng)驗豐富、技術(shù)水平穩(wěn)定的醫(yī)師，可獲得較理想的診斷結(jié)果。加之操作簡單、對患者創(chuàng)傷小及可重復(fù)使用等優(yōu)點，該診斷方法已成為臨床鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性最為常用的方法。然而，F(xiàn)NAC以細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征為主要診斷依據(jù)，因每次的取樣量較少，取樣點是否具有典型性和代表性直接干預(yù)診斷結(jié)果，就這方面而言，F(xiàn)NAC也存在一定的局限性，不能反映病灶全貌，因此臨床存在漏診和誤診的情況。

BRAF首先發(fā)現(xiàn)于人類尤文氏肉瘤，是一組能對NIH3T3細(xì)胞進(jìn)行傳染且具有生物學(xué)活性的DNA序列，因其與CRAF基因、ARAF基因具有高度同源性而得以命名[6]。V600E點突變是BRAF基因中最常見的遺傳病變，與侵襲性疾病具有高度相關(guān)性，近年研究發(fā)現(xiàn)[7]，V600E點突變是促進(jìn)甲狀腺疾病癌變的一個重要因素，與患者預(yù)后密切相關(guān)。因分子病理學(xué)的改變常早于細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，分子病理標(biāo)記物的檢測，可在一定程度上彌補(bǔ)細(xì)胞形態(tài)學(xué)不典型和取樣不佳帶來的診斷偏差[8]。本組病例經(jīng)術(shù)后病理證實良性病灶61例，惡性病變42例，F(xiàn)NAC單獨診斷甲狀腺癌的靈敏度和特異度分別為73.8%和93.4%，漏診率和誤診率分別為26.2%和6.6%，該結(jié)果與國內(nèi)多數(shù)報道水平相符。聯(lián)合BRAF基因突變后，其靈敏度和特異度均有不等程度的提高，分別為90.5%、98.4%，漏診率和誤診率明顯降低，分別為9.5%和1.6%，其中靈敏度、漏診率及診斷符合率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均＜0.05）?？梢姡現(xiàn)NAC 與BRAF基因突變聯(lián)合檢測鑒別甲狀腺疾病良惡性可提高診斷效能。

表1　診斷標(biāo)準(zhǔn)

表2　FNAC、BRAF基因突變檢查與手術(shù)病理結(jié)果例

表3　FNAC、BRAF基因突變檢查及聯(lián)合檢測診斷價值評價例（%）

[1]張博茗,林元強(qiáng),隋國慶,等.細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)聯(lián)合BRAF～（V600E）基因突變檢測在甲狀腺結(jié)節(jié)診斷中的價值[J].腫瘤影像學(xué),2015,24(4):259-263.

[2] 李小強(qiáng),張惠箴,蔣智銘,等.甲狀腺乳頭狀癌中BRAF基因的表達(dá)及意義[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志,2012,28(9):991-995.

[3]林振中,劉東利,王惠萍,等.甲狀腺結(jié)節(jié)細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查的診斷價值[J].中國腫瘤外科雜志,2015,7(4):235-237,252.

[4]吳亮,楊順實,江學(xué)慶,等.超聲引導(dǎo)下甲狀腺結(jié)節(jié)細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查的術(shù)前診斷價值[J].中國臨床醫(yī)學(xué)影像雜志,2014,25(1):17-20.

[5] 鹿瑤,魏瑩,李晨曦,等.超聲引導(dǎo)下甲狀腺細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查及液基薄層細(xì)胞學(xué)在甲狀腺疾病診斷中的應(yīng)用價值[J].生物醫(yī)學(xué)工程與臨床,2015,19(4):362-365.

[6] 陳思睿,曹仁賢.BRAF基因與甲狀腺癌分子診療的研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新, 2013,10(2):161-162.

[7]李菲,盛春君,曲伸,等.分子標(biāo)記物在甲狀腺結(jié)節(jié)細(xì)針穿刺中的診斷價值[J].中華臨床醫(yī)師雜志:電子版,2013,7(24): 11709-11712.

[8] 江曉燊,解乃昌.甲狀腺乳頭狀癌BRAF V600E突變蛋白質(zhì)的表達(dá)及意義[J].廣東醫(yī)學(xué),2013,34(6):931-933.

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.05.054

R446.6

A

1671-0800(2016)05-0665-02

2016-01-10

（本文編輯：陳志翔）

318050浙江省臺州，臺州醫(yī)院

徐偉銘，Email：xuwm@enzemed.com