辛　穎　達拉胡　紅　艷（內(nèi)蒙古民族大學蒙醫(yī)藥學院　通遼　028000）

蒙藥梅花草乙醇提取物體外抗腫瘤實驗研究△

辛穎達拉胡紅艷（內(nèi)蒙古民族大學蒙醫(yī)藥學院通遼028000）

目的：研究蒙藥梅花草乙醇提取物對人宮頸癌細胞（Hela細胞）的體外增殖抑制作用。方法：采用MTT法檢測梅花草乙醇提取物的不同劑量組對Hela細胞增殖的抑制作用；以單克隆抗體ELISA法檢測凋亡細胞。結(jié)果：梅花草乙醇提取物處理Hela細胞24h后，可以明顯抑制Hela細胞的增殖。與對照組相比，梅花草乙醇提取物可以明顯促進Hela細胞的凋亡。結(jié)論：蒙藥梅花草的乙醇提取物體外對Hela細胞的增殖有抑制作用，其作用機制可能與誘導腫瘤細胞的凋亡有關(guān)。

梅花草乙醇提取物 Hela細胞 細胞凋亡 ELISA法

梅花草（Parnassis palustris L.），又稱白側(cè)草、馬蹄草、黃草小白花，為虎耳草科梅花草屬植物突隔梅花草的全草或根，蒙古名為那木戛納、烏力地格和那木日因查干-其其格等，是蒙古族歷代民間常用的特色蒙藥，在現(xiàn)代蒙醫(yī)臨床應(yīng)用中是治療腫瘤及其相關(guān)疾病的常用蒙藥材之一。梅花草氣味甘、苦，無毒，具有清熱解毒、消腫排膿、破痞、抑希日等功效，臨床主要用于黃疸型肝炎、肺結(jié)核、喉炎、腮腺炎、脈管炎等，也可治療腑器熱性希日病和熱性痞癥，即治療肝、膽腫瘤及部分腸道腫瘤（如結(jié)腸腫瘤）等［1，2］。

“破痞”屬于一種蒙藥功效，相當于現(xiàn)代醫(yī)學中的抗腫瘤作用?，F(xiàn)代蒙藥藥理學［3］認為具有破痞功效的蒙藥具有抗腫瘤活性。蒙醫(yī)理論認為“痞癥”可發(fā)生于人體的各個器官，多屬于繼發(fā)于各種疾病的郁結(jié)性痼疾，發(fā)病原因主要是維持人體生命的“三根”（赫依、希日、巴達干）由于某種原因失去平衡，使“七素”（食物精華、血、肉、脂、骨、骨髓、精液）的轉(zhuǎn)化過程中因積聚凝結(jié)而成渾濁、惡血激增、黃水淤積，在赫依的促動作用下，在人體的某一部位形成痞塊。醫(yī)治痞病，不但要破痞瘤也要判明發(fā)病原因，對癥施治。長期以來，蒙醫(yī)藥學對于“痞癥”的治療方面積累了非常豐富的治療方法和傳統(tǒng)用藥經(jīng)驗，臨床療效顯著，副作用小，資源豐富。但存在的挑戰(zhàn)在于如何利用現(xiàn)代醫(yī)藥學理念解釋蒙醫(yī)藥“破痞”功效的機制。

近年來國內(nèi)外學者對中藥抗腫瘤作用機制及其有效物質(zhì)基礎(chǔ)進行了大量的研究，實驗結(jié)果證實我國的傳統(tǒng)中藥具有良好的抗腫瘤效果，副作用較?。?，5，6］。據(jù)文獻查閱，目前未見國內(nèi)外專家和學者對蒙藥梅花草活性化學成分和作用機制等方面的研究報道。從天然藥物的發(fā)展趨勢來看，應(yīng)該將化學成分和藥效學研究結(jié)合起來進行研究，應(yīng)該以天然藥物的有效部位為切入點，對其有效部位進行提取分離，了解其主要活性成分，進一步尋找其作用機制。本研究沿著天然藥物研究的這一思路，首先擬用活性追蹤法對蒙藥梅花草的乙醇提取物的抗腫瘤作用進行研究，旨在通過體外實驗初步評價梅花草乙醇提取物對人宮頸癌細胞（Hela細胞）的增殖是否具有抑制作用，進一步研究梅花草的抗腫瘤效果。

1　實驗材料

1.1細胞：人宮頸癌細胞系（Hela細胞）購自上海博谷生物科技有限公司。

1.2儀器：倒置相差顯微鏡（TS100型，日本尼康）；雙人雙面凈化工作臺（SW-CJ-2F型，蘇州智凈有限公司）；酶標儀（DNM-9602型，北京普朗責任有限公司）；水套式C02培養(yǎng)箱（3110系列，美國Thermo Scientific）；超純水機（GYJ1/2-40L-S型，重慶華創(chuàng)責任有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LS-100A型，上海博訊有限公司）；鼓風干燥箱（DHG-9203A型，上海精宏有限公司）；電子調(diào)溫電熱套（98-1B型，天津市秦斯特儀器有限公司）；超聲波清洗器（KQ-100型，昆山市超聲儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Heidolph集團）；循環(huán)水式多用真空泵（SHZ-DIII型，鄭州長城儀器有限公司）；96孔培養(yǎng)板及培養(yǎng)瓶（美國Corning公司）。

1.3試劑：DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；MTT（北京索萊寶科技有限公司）；胰酶（北京索萊寶科技有限公司）；生理鹽水、乙醇、二甲基亞砜（DMS0）等試劑均購自天津科密歐公司。

2　實驗方法

2.1藥物制備：取一定量的梅花草（500g），用95%的乙醇浸泡后放于大圓底燒瓶中加熱浸煮，每次煮3h，提取3次，每次所得的煮液合并為提取液，減壓濃縮干燥后得浸膏，備用。經(jīng)計算得提取率為33.26%。用DMS0作為梅花草乙醇提取物的溶劑用于細胞實驗。

2.2MTT實驗：用0.08%的胰酶消化Hela細胞后，將細胞濃度調(diào)整為1×105/mL，每孔100μL細胞懸液分別接種于96孔板中，培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度的梅花草乙醇提取物處理細胞，在C02培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24h，小心吸棄每孔內(nèi)的培養(yǎng)液，每孔再加入MTT工作液（5mg/mL）50μL，繼續(xù)恒溫（37℃）培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)后小心吸棄孔內(nèi)MTT，每孔加入100μL DMS0，振蕩2～3min后使用酶標儀（選擇490nm波長）檢測各孔的0D值，記錄各組結(jié)果并計算抑制率。抑制率=（對照組0D值-實驗組0D值）/對照組0D值×100%，實驗重復3次，取平均值。

2.3ELISA檢測凋亡細胞：Hela細胞加入梅花草的乙醇提取物處理24h后，用PBS洗滌2次，使用抗組蛋白和抗DNA的單克隆抗體ELISA法早期檢測細胞凋亡，按試劑盒的說明方法進行操作，在酶標檢測儀上于波長405nm處測定各孔0D值。凋亡細胞率以富集系數(shù)EF表示，EF值=（待測樣品0D值-本底0D值）/陰性對照0D值×100%。

2.4統(tǒng)計學方法：應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行分析，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，多組間均數(shù)差異性比較采用單因素方差分析，P＜0.05或P＜0.01為差異具有統(tǒng)計學意義。

3　實驗結(jié)果

3.1梅花草乙醇提取物對Hela細胞的增殖抑制作用：梅花草乙醇提取物在濃度為12.5mg/mL時對Hela細胞表現(xiàn)出抑制其增殖的作用，結(jié)果見表1。

表1　梅花草乙醇提取物對Hela細胞增殖的作用

3.2梅花草乙醇提取物對Hela細胞凋亡的影響：與對照組相比，梅花草乙醇提取物濃度為12.5mg/mL的劑量組中凋亡細胞率（EF）明顯升高（P＜0.05），結(jié)果見表2。

表2　梅花草乙醇提取物對Hela細胞凋亡的影響

4　討論

腫瘤已經(jīng)成為危害人類健康和幸福的殺手，防治腫瘤依然是世界性難題。目前對腫瘤采取的手術(shù)治療、化學藥物治療和放射線治療等手段的結(jié)合應(yīng)用使多種腫瘤的治愈率有了極大的提高，但腫瘤細胞的多重耐藥性和抗腫瘤藥物的毒副作用使尋找新的抗腫瘤藥物的研究刻不容緩。蒙藥治療腫瘤有獨特的經(jīng)驗和方法，臨床治療時采用辨治施治的方法。蒙藥用藥劑量小，有高效、低毒、發(fā)揮復合藥理作用、療效可靠等優(yōu)點，其有效成分的抗腫瘤作用及其機理的研究已成為當今醫(yī)藥學領(lǐng)域研究的重點。

本實驗研究的結(jié)果顯示，梅花草乙醇提取物的不同劑量組對Hela細胞可以表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，且呈現(xiàn)劑量反應(yīng)關(guān)系。細胞凋亡可以維持機體內(nèi)細胞數(shù)量的動態(tài)平衡，進一步加強機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，是細胞的一種基本生物學現(xiàn)象［7］。實驗結(jié)果表明，梅花草乙醇提取物可以促進Hela細胞發(fā)生早期凋亡。綜上所述，梅花草乙醇提取物在體外對Hela細胞有抑制作用，且其作用機制與誘導腫瘤細胞的凋亡有關(guān)。

［1］羅布桑.蒙藥學［M］.北京：民族出版社，1989：459-460.

［2］奧烏力吉，布和巴特爾.傳統(tǒng)蒙藥與方劑［M］.呼和浩特：內(nèi)蒙古科學技術(shù)出版社，2013，8.

［3］王秀蘭，白玉霞，王歡，等.蒙藥藥理學［M］.呼和浩特：內(nèi)蒙古人民出版社，2006：82-87.

［4］尹龍，徐亮，胡格，等.抗腫瘤中藥及其有效成分的作用研究現(xiàn)狀［J］.動物醫(yī)學進展，2006，27（1）：39-44.

［5］劉磊磊，陳娟，師彥平.清熱解毒中藥抗腫瘤作用研究進展［J］.中草藥，2012，43（6）：1203-1212.

［6］梁欣娜，張興燊，滕紅麗.中藥及其有效成分抗腫瘤作用研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2013，24（1）：119-122.

［7］歐陽高亮，李祺福，洪水根.細胞凋亡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和治療［J］.國外醫(yī)學（腫瘤學分冊），2000，27（5）：266-269.

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1672-8351（2016）09-0128-02

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學基金資助（2016MS0817）；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學?？茖W研究項目（NJZZ16184）。