戴　暉　蒙鳳貞（廣東省佛山市第一人民醫(yī)院（中山大學附屬佛山醫(yī)院）藥學部　佛山　528000）

高效液相色譜法測定何首烏中二苯乙烯苷及大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷的含量

戴暉蒙鳳貞（廣東省佛山市第一人民醫(yī)院（中山大學附屬佛山醫(yī)院）藥學部佛山528000）

目的：探討高效液相色譜法（HPLC法）對何首烏中有效成分二苯乙烯苷及大黃素-8-0-β-D-葡萄糖苷含量進行測定。方法：采用Phenomenex C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱，流動相選擇乙腈∶水=25∶75，流速為1.0mL/min，檢測波長為322nm，柱溫為25℃。結(jié)果：二苯乙烯苷的線性回歸方程為：Y=3.247×105X+1.951×104（r=0.9999），在4.021～40.12μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；大黃素-8-0-β-D-葡萄糖苷線性回歸方程為：Y=1.501×105X+0.352×104（r=0.9998），在0.012～25.00μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。二苯乙烯苷的平均加樣回收率為99.79%，RSD=1.23%，大黃素-8-0-β-D-葡萄糖苷平均加樣回收率為99.51%，RSD=1.52%。結(jié)論：高效液相色譜法測定何首烏中的兩種有效成分，操作簡單快速，穩(wěn)定性好，精密度高，重現(xiàn)性好，為何首烏中有效成分的含量測定提供了有效的方法。

高效液相色譜法 何首烏 二苯乙烯苷 大黃素-8-0-β-D-葡萄糖苷

何首烏始載于《開寶本草》，是寥科植物何首烏（Polygonum multiflorum Thumb）的干燥塊根［1］，有我國傳統(tǒng)“四大仙草”之一的美稱。何首烏具有解毒、截瘧、消癰、潤腸通便的功效，臨床上用于治療瘡癰、久瘧體虛、腸燥便秘等［2］。對于何首烏的成分研究多集中在其有效成分二苯乙烯苷類、蒽醌類、黃酮類以及磷脂類等的研究中［3］，目前對于核苷類成分的分析方法主要有熒光法、離子交換色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等［4］。本次研究采用了高效液相色譜法對何首烏中二苯乙烯苷和蒽醌類成分大黃素-8-0-β-D-葡萄糖苷進行含量測定，為何首烏藥材質(zhì)量的綜合評價提供可靠的檢測手段。

1　實驗材料

1.1實驗儀器：美國Waters公司生產(chǎn)的Waters717高效液相色譜儀，配有溶劑洗脫裝置、自動進樣器，Waters717色譜檢測系統(tǒng)；GR-201型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；B3201D-T型超聲波清洗器；7230型電熱鼓風干燥箱；SGDY5-III型電熱恒溫水浴箱，W2011T-I型高速冷凍離心機。

1.2實驗試藥：何首烏藥材為我市中藥材中心銷售，經(jīng)專家鑒定為真品；二苯乙烯苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110845-201206）；大黃素-8-0-β-D-葡萄糖苷（中國藥品生物制品檢定所，生產(chǎn)批號：20120425）；乙腈為色譜純（北京化工科技有限公司，生產(chǎn)批號：20130223），水為三蒸水，其他試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件的選擇：采用Phenomenex C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱，流動相選擇乙腈∶水=25∶75，流速為1.0mL/min，檢測波長為322nm，柱溫為25℃，進樣量為20μL，見圖1。

2.2對照品溶液的制備：分別取二苯乙烯苷、大黃素-8-0-β-D-葡萄糖苷對照品，精密稱定后置于同一25mL容量瓶中，用75%乙醇溶液定溶至刻度后搖勻，精密吸取3.5mL采用75%乙醇溶液定溶至10mL容量瓶中，搖勻后即得二苯乙烯苷、大黃素-8-0-β-D-葡萄糖苷混合對照品溶液。

2.3供試品溶液的制備：精密稱取中藥材何首烏1.0g粉碎后，加入75%乙醇溶液100mL溶解后放置于回流瓶內(nèi)，水浴鍋中加熱煮沸后回流提取45min后，冷卻并稱定質(zhì)量，用75%乙醇溶液將損失的質(zhì)量補足后搖勻，過0.22μm的微孔濾膜，得到供試品溶液。

2.4線性關(guān)系考察：精密吸取“2.2”項下的混合對照品溶液0、0.1、0.5、2.0、5.0、10.0mL置于10mL容量瓶中，采用75%乙醇溶液定溶至刻度后，分別精密吸取20μL，按照“2.1”項下的色譜條件進行測定，以對照品的峰面積值作為縱坐標，對應(yīng)的濃度值作為橫坐標繪制線性回歸方程。二苯乙烯苷的線性回歸方程為：Y=3.247×105X+1.951×104（r=0.9999），在4.021～40.12μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；大黃素-8-0-β-D-葡萄糖苷線性回歸方程為：Y=1.501×105X+0.352×104（r=0.9998），在0.012～25.00μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5精密度考察：精密吸取同一混合對照品溶液，按照“2.1”項下的色譜條件分別重復(fù)進樣5次，計算成分的色譜峰面積的RSD值分別為1.22%、1.04%，均符合精密度實驗的要求，表明實驗儀器的精密度良好。

2.6重復(fù)性考察：取“2.3”項下的供試品溶液，按照“2.1”項下的色譜條件重復(fù)測定5次，計算二苯乙烯苷和大黃素-8-0-β-D-葡萄糖苷含量的RSD值分別為2.3%、1.8%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性考察：取同一批次的樣品藥材按照“2.3”項下供試品溶液的制備方式配置溶液，分別在第1、2、4、6、10、12、16、24h按照“2.1”項下的色譜條件進樣，其二苯乙烯苷、大黃素-8-0-β-D-葡萄糖苷含量的RSD值分別為1.3%、1.0%，表明供試品溶液在24h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

2.8加樣回收率試驗：取已知含量的何首烏樣品共5份，精密稱定后按照“2.3”項下的供試品溶液配制方法制備溶液，分別精密加入已知含量的二苯乙烯苷、大黃素-8-0-β-D-葡萄糖苷對照品溶液，根據(jù)“2.1”項下的色譜條件及線性回歸方程樣品測定方法計算，結(jié)果見表1、表2。

表1　二苯乙烯苷加樣回收率試驗結(jié)果（n=5）

3　小結(jié)

3.1供試品溶液制備條件的選擇：本次實驗中比較了超聲提取和回流提取的效果［5］，結(jié)果表明回流提取時提取率高于超聲提取方式，提取時間短，適用于對熱敏感的有效成分的提取，因此在實驗中采用了回流提取的方式進行供試品溶液的制備。

表2　大黃素-8-0-β-D-葡萄糖苷加樣回收率試驗結(jié)果（n=5）

3.2檢測波長的選擇：通過對二苯乙烯苷紫外吸收波長的檢測，結(jié)果表明在322nm處兩種成分具有相對最大吸收波長，且無其他成分的干擾峰出現(xiàn)，因此選擇322nm作為成分的檢測波長。

3.3流動相和色譜柱溫的選擇：流動相采用了乙腈：水、甲醇：水，結(jié)果表明乙腈：水=25∶75時分離效果好。柱溫考察了溫度為20℃、25℃、30℃條件下兩種成分的分離效果，表明在25℃時兩種成分分離效果好，因此實驗時選擇了溫度為25℃的色譜條件。

［1］李文仕.反相高效液相色譜法測定何首烏顆粒中二苯乙烯苷的含量［J］.右江民族醫(yī)學院學報，2014，3（1）：362-364.

［2］彭貴龍，周光明，楊遠高，等.高效液相色譜同時測定何首烏中大磺酸、大黃素和大黃酚的含量［J］.四川大學學報，2014，51（2）：350-352.

［3］高攀峰，馮鵬飛.高效液相色譜法測定調(diào)血降脂丸中何首烏苷含量［J］.實用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2014，28（12）：119-121.

［4］林武俊，陳小玉，劉可福，等.HPLC法測定康欣膠囊中二苯乙烯苷的含量［J］.海峽藥學，2011，23（8）：80-82.

［5］羅益遠.超高效液相色譜-四級桿/線性例子質(zhì)譜法同時測定不同產(chǎn)地何首烏中10種核苷類成分［J］.分析測試學報，2015，35 （5）：519-524.

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1672-8351（2016）09-0011-02