張文政，唐繼軍，李炳志，元英進(jìn)

?

釀酒酵母基因組位置效應(yīng)對外源基因表達(dá)的影響

張文政1,2，唐繼軍2,3，李炳志1,2，元英進(jìn)1,2

1 天津大學(xué) 系統(tǒng)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300072 2 天津大學(xué) 化工學(xué)院 天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300072 3 天津大學(xué) 計(jì)算機(jī)與科學(xué)技術(shù)學(xué)院，天津 300072

外源基因元件和模塊在底盤細(xì)胞中發(fā)揮特定功能是合成生物學(xué)研究的基本過程，而外源元件和模塊在基因組中的位置對其功能的實(shí)現(xiàn)具有顯著影響。為了系統(tǒng)、全面地表征釀酒酵母基因組位置效應(yīng)對外源基因的表達(dá)影響，以綠色熒光蛋白為報(bào)告基因，通過雙交換同源重組方法，對釀酒酵母單基因敲除庫進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)化，構(gòu)建釀酒酵母基因組單位點(diǎn)熒光標(biāo)記菌株庫。結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)和高通量測序技術(shù)對單位點(diǎn)熒光標(biāo)記庫菌株進(jìn)行分析，構(gòu)建高表達(dá)位點(diǎn)庫和低表達(dá)位點(diǎn)庫，共發(fā)現(xiàn)促進(jìn)綠色熒光蛋白表達(dá)的位點(diǎn)428個，抑制綠色熒光蛋白表達(dá)的位點(diǎn)444個。通過分析高、低表達(dá)位點(diǎn)在酵母染色體上的分布，從全基因組尺度上對釀酒酵母基因組整合位置對基因表達(dá)的影響進(jìn)行表征。本研究可為釀酒酵母基因組位置效應(yīng)的分布規(guī)律和產(chǎn)生機(jī)理研究提供重要參考，對外源蛋白工業(yè)生產(chǎn)和合成生物學(xué)中的基因表達(dá)精細(xì)調(diào)控也具有重要的指導(dǎo)意義。

合成生物學(xué)，釀酒酵母，染色體位置效應(yīng)，外源基因表達(dá)

釀酒酵母具有蛋白翻譯后修飾功能，適合復(fù)雜結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)和功能發(fā)揮，被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜化合物的生產(chǎn)[1-3]。合成生物學(xué)領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展表明，外源基因元件和模塊能夠在釀酒酵母細(xì)胞中發(fā)揮功能，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜天然化合物的生 產(chǎn)[4-6]。外源基因元件或模塊通常以游離型質(zhì)粒為載體存在于釀酒酵母細(xì)胞中，或插入釀酒酵母基因組。與游離型質(zhì)粒相比，將外源基因元件或模塊整合至酵母基因組具有可精確控制拷貝數(shù)、穩(wěn)定強(qiáng)、無需抗生素或其他化合物的添加以維持篩選壓力等優(yōu)點(diǎn)。然而研究表明，釀酒酵母基因組對外源基因的表達(dá)存在明顯的位置效應(yīng)[7]，與插入位點(diǎn)相關(guān)的表觀遺傳效應(yīng)能夠影響外源基因的表達(dá)，插入本身可能會激活或者抑制某些基因，造成內(nèi)源基因的異常表達(dá)和有毒代謝產(chǎn)物的積累。因此釀酒酵母基因組位置效應(yīng)對外源基因表達(dá)的影響的研究具有重要意義。

目前，研究人員已在多種生物體系中發(fā)現(xiàn)基因組位置效應(yīng)的存在，如大腸桿菌[8]、釀酒酵 母[9-10]、乳酸乳球菌[11]、果蠅[12]和人類細(xì)胞[13]等。Yamane等[9]以為報(bào)告基因，將其整合至酵母Ⅲ號染色體的不同位點(diǎn)，通過測定β-半乳糖苷酶的活性表征的轉(zhuǎn)錄水平，對酵母Ⅲ號染色體的位置效應(yīng)進(jìn)行了研究；Bai等[10]采用類似的方法，在釀酒酵母基因組上選取了20個可能適合外源基因整合的位點(diǎn)，對插入這些位點(diǎn)的基因的表達(dá)情況進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)不同位點(diǎn)間的表達(dá)水平存在明顯差異，最高可達(dá)20倍；Thomoson等[14]的研究則采用了一種隨機(jī)插入的策略，并未對報(bào)告基因的插入位置進(jìn)行確定。上述研究僅對釀酒酵母的位置效應(yīng)對外源基因表達(dá)的影響進(jìn)行了初步探索，研究局限于有限位點(diǎn)或單條染色體，缺乏對整個釀酒酵母基因組的位置效應(yīng)系統(tǒng)、全面的探究。

釀酒酵母單基因敲除庫 (Yeast konck-out collection，簡寫為YKO)[15]含有菌株4 817株，每個菌株均有1個非必需基因的開放閱讀框 (ORF) 被表達(dá)盒替代，具有G418抗性。表達(dá)盒上下游各含有一個長度為20 bp的“條碼區(qū)”識別區(qū)，用于特異性識別被替換的非必需基因。本研究通過同源重組將表達(dá)盒替換為報(bào)告基因，結(jié)合流式細(xì)胞分選技術(shù)和高通量測序技術(shù)，構(gòu)建釀酒酵母單位點(diǎn)熒光標(biāo)記庫、高表達(dá)位點(diǎn)庫和低表達(dá)位點(diǎn)庫，實(shí)現(xiàn)對釀酒酵母基因組多位點(diǎn)上外源基因表達(dá)水平差異的表征。本研究方法具有高通量、能夠精準(zhǔn)定位插入位置的特點(diǎn)，不僅能夠篩選出增強(qiáng)和抑制外源基因表達(dá)的位點(diǎn)，而且能夠從基因組尺度上揭示酵母位置效應(yīng)的分布規(guī)律和產(chǎn)生機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

實(shí)驗(yàn)背景菌株均為S288c 菌株 BY4741 ()[16]。以BY4741為背景菌株的酵母單基因敲除庫由美國Jef D. Boeke教授實(shí)驗(yàn)室保存饋贈。大腸桿菌質(zhì)粒pUC19[17]，酵母復(fù)制型質(zhì)粒pRS416[18]，均為本實(shí)驗(yàn)室保存。帶有基因的質(zhì)粒pGRB2.3由美國Brendan Cormack教授實(shí)驗(yàn)室保存饋贈。用于質(zhì)粒擴(kuò)增的菌株為大腸桿菌DH5α，購自北京博邁德生物技術(shù)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

YPD培養(yǎng)基組成成分為10 g/L酵母浸粉，20 g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖。SD培養(yǎng)基組成成分為6.7 g/L不含氨基酸的酵母氮源，2 g/L氨基酸混合物，20 g/L葡萄糖，20 mg/L組氨酸，20 mg/L色氨酸，SD-URA缺陷型培養(yǎng)基添加100 mg/L亮氨酸，SD-LEU缺陷型培養(yǎng)基添加20 mg/L尿嘧啶，用10 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至6.5。LB培養(yǎng)基組成成分為10 g/L 氯化鈉，5 g/L酵母浸粉, 10 g/L蛋白胨，添加0.1 mg/mL氨芐霉素用于篩選。固體培養(yǎng)基添加20 g/L瓊脂粉。培養(yǎng)含有基因的菌株細(xì)胞時，培養(yǎng)基中額外添加0.2 mg/mL G418。

培養(yǎng)基所用試劑購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；? 高保真DNA聚合酶購自美國 Stratagene公司，限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自美國Fermentas公司；轉(zhuǎn)化所用PEG3350、DMSO購自美國Sigma公司，鮭魚精DNA購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。

1.3 表達(dá)盒構(gòu)建

突變pUC19質(zhì)粒去除I酶切位點(diǎn)，作為基因表達(dá)載體。采用OE-PCR法[19]構(gòu)建整合型表達(dá)盒，總長3.9 kb，由5個DNA片段組成：與基因同源的上游同源臂和下游同源臂、釀酒酵母內(nèi)源弱啟動子、開放閱讀框與其相應(yīng)的終止子和營養(yǎng)篩選標(biāo)記，PCR引物見表1。最終得到帶有表達(dá)盒的整合型質(zhì)粒pUC19M-1 (圖1)。

表1 構(gòu)建整合型表達(dá)質(zhì)粒引物列表

Table 1 Primer for constructing the designer cassette for integrative transformation

Restriction enzyme sites are indicated in bold.

1.4 釀酒酵母單位點(diǎn)熒光標(biāo)記庫的構(gòu)建

利用大腸桿菌對整合型質(zhì)粒pUC19M-1進(jìn)行擴(kuò)增，酶切回收目的DNA片段20 μg，對釀酒酵母單基因敲除庫進(jìn)行轉(zhuǎn)化。篩選出具有LEU+G418-表型的轉(zhuǎn)化子，構(gòu)建單位點(diǎn)熒光標(biāo)記菌株庫。將該菌株庫在液體SD-LEU營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)以抑制假陽性細(xì)胞的生長。取部分培養(yǎng)后的細(xì)胞稀釋涂布于YPD固體平板并翻印至SD-LEU營養(yǎng)缺陷型平板以統(tǒng)計(jì)釀酒酵母單位點(diǎn)熒光標(biāo)記庫的細(xì)胞陰性率。

1.5 釀酒酵母單位點(diǎn)熒光標(biāo)記庫的分選

將釀酒酵母單位點(diǎn)熒光標(biāo)記庫過夜培養(yǎng)，去除培養(yǎng)基后懸于PBS緩沖液中，細(xì)胞密度調(diào)整至1×107個細(xì)胞/mL。用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行分選，根據(jù)細(xì)胞熒光蛋白表達(dá)強(qiáng)度的分布圖譜 (圖2)，選取熒光蛋白表達(dá)量較高和較低的細(xì)胞，分選出的細(xì)胞數(shù)分別占細(xì)胞總量10%。將得到的細(xì)胞再次分選，去除干擾細(xì)胞，純化細(xì)胞庫，形成高表達(dá)位點(diǎn)庫和低表達(dá)位點(diǎn)庫。

圖2 釀酒酵母單位點(diǎn)熒光標(biāo)記庫菌株分選 (A：以釀酒酵母單位點(diǎn)熒光標(biāo)記庫為起始的第一輪分選，P4框中為gfp高表達(dá)細(xì)胞，P5 框中的gfp低表達(dá)細(xì)胞；B：以第一輪分選出的gfp高表達(dá)細(xì)胞為起始進(jìn)行的第二輪分選；C：以第一輪分選出的gfp低表達(dá)細(xì)胞為起始進(jìn)行的第二輪分選)

1.6 高/低表達(dá)位點(diǎn)庫的測定與分析

提取釀酒酵母單基因敲除庫、釀酒酵母單位點(diǎn)熒光標(biāo)記庫、高表達(dá)位點(diǎn)庫和低表達(dá)位點(diǎn)庫的基因組DNA，采用Tag-array hybridization法[20]測定表達(dá)盒上下游“條碼區(qū)”的DNA序列，確定庫中所含菌株和基因插入位置。

2 結(jié)果與討論

為了系統(tǒng)研究釀酒酵母基因組位置效應(yīng)對外源基因表達(dá)的影響，本實(shí)驗(yàn)中對釀酒酵母單基因敲除庫進(jìn)行了高通量轉(zhuǎn)化，以報(bào)告基因替換單基因敲除菌株的序列。通過對轉(zhuǎn)化子的表型篩選，得到1.3×104個具有LEU+G418-表型的轉(zhuǎn)化子，構(gòu)建釀酒酵母基因組單位點(diǎn)熒光標(biāo)記菌株庫。釀酒酵母單基因敲除庫中共有菌株4 817株，根據(jù)計(jì)算，單位點(diǎn)熒光標(biāo)記庫對單基因敲除庫的覆蓋率為2.6倍，單個單基因敲除菌株被轉(zhuǎn)化的概率為92.8%。單基因敲除菌株庫中存在部分生長緩慢菌株，在培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化過程中可能遺失；某些基因的缺失會對整合型轉(zhuǎn)化產(chǎn)生影響[21]；此外，長片段外源DNA的整合型轉(zhuǎn)化效率遠(yuǎn)低于游離型質(zhì)粒轉(zhuǎn)化?？紤]上述因素，我們認(rèn)為實(shí)驗(yàn)中所構(gòu)建的釀酒酵母單點(diǎn)熒光標(biāo)記庫基本實(shí)現(xiàn)了對原單基因敲除庫的替換。

與抗性篩選不同，營養(yǎng)缺陷型篩選過程中會產(chǎn)生假陽性轉(zhuǎn)化子，為避免這些轉(zhuǎn)化子影響后續(xù)的分選和測序，實(shí)驗(yàn)中對酵母單位點(diǎn)熒光標(biāo)記庫、高表達(dá)位點(diǎn)庫和低表達(dá)位點(diǎn)庫中菌株的表型進(jìn)行了驗(yàn)證。在統(tǒng)計(jì)的4 200個單位點(diǎn)熒光標(biāo)記庫菌株菌落中，表型為LEU-的菌落84個，陰性率為2% (表2)。采用同樣的方法對高、低表達(dá)位點(diǎn)庫的細(xì)胞陰性率進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示高表達(dá)位點(diǎn)庫的陰性率為0%，低表達(dá)位點(diǎn)的陰性率為1.1% (表2)。由于經(jīng)過營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基中的傳代培養(yǎng)和流式細(xì)胞儀的分選，兩者的陰性率與單位點(diǎn)熒光標(biāo)記庫菌株陰性率相比均有明顯降低。但是低位點(diǎn)表達(dá)庫仍存在1.1%的假陽性細(xì)胞，這是由于流式細(xì)胞儀的分選受精度所限，未能將部分無熒光強(qiáng)度的細(xì)胞與熒光強(qiáng)度較低的細(xì)胞區(qū)分開來。由于后續(xù)的測序?qū)嶒?yàn)?zāi)軌蚺懦訇栃跃?，因此?dāng)庫中細(xì)胞陰性率低于2%時，不會對后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成顯著影響。

表2 釀酒酵母單位點(diǎn)熒光標(biāo)記庫、高表達(dá)位點(diǎn)庫和低表達(dá)位點(diǎn)庫中菌株表型驗(yàn)證

Table 2 Phenotype verification for strains in the starting pool (SP), high-expressed pool (HP) and low-expressed pool (LP)

利用高通量測序技術(shù)測定表達(dá)盒上下游“條碼區(qū)”的DNA序列，確定釀酒酵母單位點(diǎn)熒光標(biāo)記庫中所含菌株和基因插入位置。數(shù)據(jù)分析顯示，釀酒酵母單位點(diǎn)熒光標(biāo)記庫中共含菌株3 455個，占原酵母單基因敲除庫的72%。分析測定結(jié)果少于酵母單基因敲除庫菌株數(shù)的原因如下：1) 在原始的4 817個菌株中，有部分菌株具有生長緩慢表型。這些菌株無論是在最開始的轉(zhuǎn)化操作，還是后續(xù)的培養(yǎng)、分選和測序過程中均可能因?yàn)樯L過于緩慢丟失。2)基因的缺失和插入位置的不同會對轉(zhuǎn)化效率造成影響[21]，使得部分菌株未能成功插入報(bào)告基因。3) 分析和測序過程中會造成一部分菌株的缺失。

由酵母單位點(diǎn)熒光標(biāo)記庫的流式細(xì)胞分選圖 (圖2) 可以看出，部分細(xì)胞的表達(dá)量明顯高于或低于其他細(xì)胞，說明處于這些位點(diǎn)上的基因表達(dá)受位置影響較大。

實(shí)驗(yàn)中將位置效應(yīng)明顯的細(xì)胞分選出來，構(gòu)建高表達(dá)位點(diǎn)庫和低表達(dá)位點(diǎn)庫。測序分析結(jié)果顯示，高表達(dá)位點(diǎn)庫中含有菌株428個，占單位點(diǎn)標(biāo)記庫的12%；低表達(dá)位點(diǎn)庫中含有菌株444個，占單位點(diǎn)標(biāo)記庫的13% (菌株列表見補(bǔ)充材料)。在熒光顯微鏡下觀察酵母單位點(diǎn)熒光標(biāo)記庫、高表達(dá)位點(diǎn)庫菌株細(xì)胞的表達(dá)情況 (圖3)，圖3B為酵母單位點(diǎn)熒光標(biāo)記庫細(xì)胞的觀察結(jié)果，可以看出細(xì)胞之間熒光強(qiáng)度存在明顯差異；圖3C為高表達(dá)庫菌株的細(xì)胞，其熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于低表達(dá)庫菌株的細(xì)胞 (圖3D)。對酵母單位點(diǎn)熒光標(biāo)記庫、高表達(dá)位點(diǎn)庫和低位點(diǎn)表達(dá)庫熒光表達(dá)強(qiáng)度的定量測定與鏡檢結(jié)果相吻合 (圖4)。圖4B為未分選的酵母單位點(diǎn)熒光標(biāo)記庫細(xì)胞的熒光蛋白表達(dá)量分布圖，沿橫坐標(biāo)軸分布較為分散，說明庫中細(xì)胞熒光蛋白表達(dá)量差異較大；圖4C為高表達(dá)位點(diǎn)庫細(xì)胞的熒光蛋白表達(dá)量分布，與圖4B相比明顯沿坐標(biāo)軸向右偏移，說明細(xì)胞中熒光蛋白的表達(dá)量明顯增強(qiáng)；而從代表低表達(dá)位點(diǎn)庫的圖4D中可以看出，細(xì)胞分布沿坐標(biāo)軸右移，說明細(xì)胞中熒光蛋白的表達(dá)量明顯降低。通過分布圖的量化數(shù)據(jù)可知，低表達(dá)位點(diǎn)庫菌株的平均表達(dá)量為18.02，高表達(dá)位點(diǎn)庫菌株的平均表達(dá)量為137.84，為低表達(dá)位點(diǎn)庫平均表達(dá)量的7.6倍。

圖3 熒光顯微鏡下釀酒酵母單基因敲除庫、高表達(dá)位點(diǎn)庫和低表達(dá)位點(diǎn)庫的綠色熒光蛋白表達(dá)情況(A：未轉(zhuǎn)化的釀酒酵母單基因敲除庫細(xì)胞；B：未經(jīng)過分選的釀酒酵母單位點(diǎn)熒光標(biāo)記庫細(xì)胞；C：高表達(dá)位點(diǎn)庫細(xì)胞；D：低表達(dá)位點(diǎn)庫細(xì)胞。左側(cè)圖片為白光觀測，曝光時間100 ms；右側(cè)圖片為熒光觀測，曝光時間2 000 ms)

圖4 gfp表達(dá)量測定圖 (A：未轉(zhuǎn)化的釀酒酵母單基因敲除庫；B：未經(jīng)過分選的釀酒酵母單位點(diǎn)熒光標(biāo)記庫；C：經(jīng)過兩輪分選得到的高表達(dá)位點(diǎn)庫；D：經(jīng)過兩輪分選得到的低表達(dá)位點(diǎn)庫)

為了進(jìn)一步探尋釀酒酵母位置效應(yīng)的分布規(guī)律，將高表達(dá)位點(diǎn)庫和低表達(dá)位點(diǎn)庫中報(bào)告基因所在位點(diǎn)繪制成圖譜 (圖5)。高/低表達(dá)位點(diǎn)分布圖顯示，對于外源基因表達(dá)存在顯著影響的位點(diǎn)在酵母基因組的16條染色體上均有分布。一些高表達(dá)和低表達(dá)位點(diǎn)集中分布在染色體的特定位置，呈現(xiàn)出一定的區(qū)域性。存在下調(diào)基因表達(dá)的“抑制區(qū)”和上調(diào)外源基因表達(dá)的“熱點(diǎn)區(qū)”。一個典型的例子就是端粒位置效應(yīng)，表現(xiàn)為處于端粒序列附近的基因的表達(dá)受到抑制[22]。從圖5中可以看出，低表達(dá)位點(diǎn)在端粒位置的分布較為集中，如Ⅶ號、ⅪⅤ號染色體，端粒沉默效應(yīng)抑制了其附近位點(diǎn)基因的表達(dá)，這一現(xiàn)象與染色質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)有關(guān)[23-24]。此外，低表達(dá)位點(diǎn)還多集中于著絲粒位置和位點(diǎn)，產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因?yàn)橹z粒和位點(diǎn)具有特殊的DNA序列，容易與蛋白質(zhì)結(jié)合形成穩(wěn)定的聚合體，不利于外源蛋白的表達(dá)[25-26]。除上述位點(diǎn)之外，染色體上還存在一些外源基因表達(dá)抑制區(qū)，如Ⅱ號染色體的100-119 kb位置，Ⅷ號染色體的136-159位置，ⅩⅥ號染色體的226-204 kb位置等，其抑制機(jī)理有待進(jìn)一步研究。此外，在染色體上存在一些高表達(dá)位點(diǎn)相對較為集中的熱點(diǎn)區(qū)域，Yamane等[8]和Flagfeldt等[10]在其針對釀酒酵母基因組位置效應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)熱點(diǎn)區(qū)域附近存在自主復(fù)制序列 (ARS)，促進(jìn)外源基因的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一現(xiàn)象并發(fā)現(xiàn)了更多類似熱點(diǎn)區(qū)，如Ⅳ號染色體755-768 kb (ARS423)，Ⅶ號染色體828-849 kb (ARS731)，ⅩⅥ號染色體455-465 kb (ARS1633)等。研究過程中我們還發(fā)現(xiàn)一些熱點(diǎn)區(qū)域能夠造成外源基因表達(dá)量增加，如Ⅷ染色體320-336 kb，ⅩⅢ染色體571-589 kb等。但其作用機(jī)理尚不明確。

圖5 高/低表達(dá)位點(diǎn)在釀酒酵母染色體上的分布示意圖 (線上部黃色點(diǎn)代表高表達(dá)位點(diǎn)；線下部藍(lán)色點(diǎn)代表低表達(dá)位點(diǎn)；線中紅色點(diǎn)代表染色體著絲粒；Ⅲ號染色體上的紅線代表交配型位點(diǎn) (HML和HMR))

本研究以釀酒酵母單基因敲除庫為基礎(chǔ)，構(gòu)建釀酒酵母基因組單位點(diǎn)熒光標(biāo)記庫、高表達(dá)位點(diǎn)庫和低表達(dá)位點(diǎn)庫，從全基因組尺度上對釀酒酵母基因組的位置效應(yīng)進(jìn)行了表征。獲得高表達(dá)位點(diǎn)428個，低表達(dá)位點(diǎn)444個。通過對這些位點(diǎn)分布的分析揭示了位置效應(yīng)在染色體上的分布規(guī)律。研究結(jié)果對合成生物學(xué)研究中精確調(diào)控外源基因表達(dá)和重要蛋白生產(chǎn)工業(yè)都具有重要的指導(dǎo)意義。

致謝：感謝美國紐約大學(xué)的Jef D. Boeke教授對本研究的悉心指導(dǎo)和支持；本文的測序工作和位點(diǎn)圖譜繪制得到了Boeke課題組Anna Sliva和Zheng Kuang的協(xié)助，在此對他們表示感謝。

REFERENCES

[1] Ro DK, Paradise EM, Ouellet M, et al. Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast. Nature, 2006, 440(7086): 940–943.

[2] Luo YZ, Li BZ, Liu D, et al. Engineered biosynthesis of natural products in heterologous hosts. Chem Soc Rev, 2015, 44(15): 5265–5290.

[3] Froissard M, D'andréa S, Boulard C, et al. Heterologous expression of AtClo1, a plant oil body protein, induces lipid accumulation in yeast. FEMS Yeast Res, 2009, 9(3): 428–438.

[4] Engles B, Dahm P, Jennewein S. Metabolic engineering of taxadiene biosynthesis in yeast as a first step towards Taxol (Paclitaxel) production. Metab Eng, 2008, 10(3/4): 201–206.

[5] Fossati E, Ekins A, Narcross L, et al. Reconstitution of a 10-gene pathway for synthesis of the plant alkaloid dihydrosanguinarine inNat Commun, 2014, 5: 3283.

[6] Siddiqui MS, Thodey K, Trenchard I, et al. Advancing secondary metabolite biosynthesis in yeast with synthetic biology tools. FEMS Yeast Res, 2012, 12(2): 144–170.

[7] Velculescu VE, Zhang L, Zhou W, et al. Characterization of the yeast transcriptome. Cell, 1997, 88(2): 243–251.

[8] Sousa C, de Lorenzo V, Cebolla A. Modulation of gene expression through chromosomal positioning in. Microbiology, 1997, 143(6): 2071–2078.

[9] Yamane S, Yamaoka M, Yamamoto M, et al. Region specificity of chromosome Ⅲ on gene expression in the yeast. J Gen Appl Microbiol, 1998, 44(4): 275–281.

[10] Bai Flagfeldt D, Siewers V, Huang L, et al. Characterization of chromosomal integration sites for heterologous gene expression in. Yeast, 2009, 26(10): 545–551.

[11] Siezen RJ, Bayjanov JR, Felis GE, et al. Genome-scale diversity and niche adaptation analysis ofby comparative genome hybridization using multi-strain arrays. Microb Biotechnol, 2011, 4(3): 383–402.

[12] Markstein M, Pitsouli C, Villalta C, et al. Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Nat Genet, 2008, 40(4): 476–483.

[13] Gierman HJ, Indemans MHG, Koster J, et al. Domain-wide regulation of gene expression in the human genome. Genome Res, 2007, 17(9): 1286–1295.

[14] Thompson A, Gasson MJ. Location effects of a reporter gene on expression levels and on native protein synthesis inand. Appl Environ Microbiol, 2001, 67(8): 3434–3439.

[15] Winzeler EA, Shoemaker DD, Astromoff A, et al. Functional characterization of thegenome by gene deletion and parallel analysis. Science, 1999, 285(5429): 901–906.

[16] Brachmann CB, Davies A, Cost GJ, et al. Designer deletion strains derived fromS288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast, 1998, 14(2): 115–132.

[17] Yanisch-Perron C, Vieira J, Messing J, et al. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene, 1985, 33(1): 103–119.

[18] Sikorski RS, Hieter P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in. Genetics, 1989, 122(1): 19–27.

[19] Horton RM, Hunt HD, Ho SN, et al. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene, 1989, 77(1): 61–68.

[20] Pan XW, Yuan DS, Ooi SL, et al. dSLAM analysis of genome-wide genetic interactions in. Methods, 2007, 41(2): 206–221.

[21] Aslankoohi E, Voordeckers K, Sun H, et al. Nucleosomes affect local transformation efficiency. Nucl Acids Res, 2012, 40(19): 9506–9512.

[22] Ottaviani A, Gilson E, Magdinier F. Telomeric position effect: from the yeast paradigm to human pathologies?. Biochimie, 2008, 90(1): 93–107.

[23] Grewal SIS, Moazed D. Heterochromatin and epigenetic control of gene expression. Science, 2003 301(5634): 798–802.

[24] Fox CA, McConnell KH. Toward biochemical understanding of a transcriptionally silenced chromosomal domain in. J Biol Chem, 2005, 280(10): 8629–8632.

[25] Smith JS, Boeke JD. An unusual form of transcriptional silencing in yeast ribosomal DNA. Genes Dev, 1997, 11(2): 241–254.

[26] Aparicio OM, Billington BL, Gottschling DE. Modifiers of position effect are shared between telomeric and silent mating-type loci in. Cell, 1991, 66(6): 1279–1287.

Effect of integration loci of genome on heterologous gene expression in

Wenzheng Zhang1,2, Jijun Tang2,3, Bingzhi Li1,2, and Yingjin Yuan1,2

1 Key Laboratory of Systems Bioengineering (Ministry of Education), Tianjin University, Tianjin 300072, China 2 SynBio Research Platform, Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering (Tianjin), School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China 3 School of Computer Science and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China

Chromosomal integration of heterologous genes or pathways is preferred over the use of episomal plasmids for its inherently stability and thus more desirable in the industrial setting. However, the position of integration of heterologous genes in the genome influences the expression levels. In combination of high throughput transformation of the Yeast Knock-out Collection (YKO) and FACS analysis, the position effect on heterologous reporter genewas identified across the whole genome in yeast. In total 428 high-expressed sites and 444 low-expressed sites were spotted, providing massive data to analyze patterns and reasons for region dependency of gene expression on the genome-wide scale.

synthetic biology,, chromosomal region, heterologous gene expression

October 21, 2015; Accepted: December 4, 2015

張文政, 唐繼軍, 李炳志, 等. 釀酒酵母基因組位置效應(yīng)對外源基因表達(dá)的影響. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(7): 901–911.

Zhang WZ, Tang JJ, Li BZ, et al. Effect of integration loci of genome on heterologous gene expression in. Chin J Biotech, 2016, 32(7): 901–911.

Supported by: International Science and Technology Cooperation Program of China (No. 2015DFA00960), National Natural Science Foundation of China (No. 21390203), Tianjin Municipal Science and Technology Program (No. 13RCGFSY19800).

Corresponding author: Bingzhi Li. Tel: +86-22-27402503; Fax: +86-22-27403888; E-mail: bzli@tju.edu.cn

國家國際科技合作項(xiàng)目 (No. 2015DFA00960)，國家自然科學(xué)基金 (No. 21390203)，天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目 (No. 13RCGFSY19800) 資助。

(本文責(zé)編 郝麗芳)