張璐，徐晉暤，麻錦彪

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一種結(jié)合SELEX與二代測(cè)序技術(shù)篩選RNA結(jié)合蛋白特異識(shí)別序列新方法的建立

張璐，徐晉暤，麻錦彪

復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)系 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438

RNA結(jié)合蛋白通過特異識(shí)別RNA底物發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化 (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX) 技術(shù)是一種體外篩選核酸底物的基本方法，SELEX技術(shù)通過重復(fù)多輪篩選從隨機(jī)核酸序列庫(kù)中篩選出特異性與靶物質(zhì)高度親和的核酸底物，本研究將利用該技術(shù)與二代高通量測(cè)序 (NGS) 相結(jié)合，體外合成含有20個(gè)隨機(jī)堿基的RNA文庫(kù)，將所要研究的蛋白構(gòu)建到帶有可被鏈親和酶素磁珠捕獲的SBP標(biāo)記的載體上去，顯著提高篩選效率，僅需1輪篩選即可獲得所需RNA底物motif。通過該方法獲得了人的hnRNP A1的UP1結(jié)構(gòu)域特異識(shí)別AGG和AG二種RNA序列，并通過EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可以與獲得的RNA motif結(jié)合。這一方法的建立對(duì)于研究RNA結(jié)合蛋白識(shí)別底物的序列特異性，并進(jìn)一步了解其在生物體內(nèi)的調(diào)控機(jī)制有重要意義。

SELEX，高通量測(cè)序技術(shù)，hnRNP A1，RNA motif

SELEX技術(shù)是Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment的縮寫，即指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)。該技術(shù)根據(jù)DNA/RNA結(jié)合蛋白的能力，從隨機(jī)的DNA/RNA文庫(kù)中找到高親和力的DNA/RNA[1-3]。1990年，Tuerk等[4]應(yīng)用該技術(shù)從人工構(gòu)建的隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)中篩選到能特異性結(jié)合噬菌體T4 DNA聚合酶的寡核苷酸配體。這項(xiàng)技術(shù)自1990年發(fā)現(xiàn)至今，已經(jīng)應(yīng)用于多種不同靶物質(zhì)的篩選[5-6]。傳統(tǒng)的SELEX技術(shù)的主要技術(shù)流程是：體外化學(xué)合成一個(gè)寡核苷酸文庫(kù)，再與靶蛋白混合，形成蛋白-核酸復(fù)合物，洗去未與靶蛋白結(jié)合的核酸，分離與靶蛋白結(jié)合的核酸并擴(kuò)增，重復(fù)多輪的篩選，最后構(gòu)建克隆文庫(kù)，挑取50–100個(gè)克隆測(cè)序，分析數(shù)據(jù)才能獲得最適核酸配體。而二代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，因其測(cè)序數(shù)據(jù)通量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于一代測(cè)序[7]，將其應(yīng)用于SELEX篩選核酸配體的新方法對(duì)蛋白-核酸底物的識(shí)別提供了更加深入的認(rèn)識(shí)[8-10]。

本研究主要是基于SELEX篩選方法，結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，研究人的hnRNP A1的RRMs結(jié)構(gòu)域特異識(shí)別的RNA motif，hnRNP A1是一種核糖核蛋白，重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子[11]。其N端含有兩個(gè)RRM結(jié)構(gòu)域，RRM1和RRM2，也被稱為UP1 (1-196) 結(jié)構(gòu)域，通過UP1參與底物RNA的特異性識(shí)別[12]，hnRNP A1參與調(diào)控不依賴于mRNA的5′帽子結(jié)構(gòu)的翻譯過程[13]，microRNA的形成[14]以及可變剪切位點(diǎn)的選擇[15]。已有研究利用SELEX篩選技術(shù)找出hnRNP A1的高親和力結(jié)合位點(diǎn)UAGGGA/U，且該位點(diǎn)類似于脊椎動(dòng)物5′和3′的剪切位點(diǎn)[16]。我們將以這一研究成果作為對(duì)照，評(píng)價(jià)SELEX與高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合發(fā)現(xiàn)RNA結(jié)合蛋白特異性識(shí)別的RNA motif的可行性。

我們?cè)隗w外合成了帶有20個(gè)隨機(jī)堿基的RNA待篩選文庫(kù)，將UP1蛋白構(gòu)建到帶有可篩選標(biāo)記的載體中，構(gòu)建了pET28a-SUMO-SBP-UP1的重組質(zhì)粒，蛋白的純化過程中切除His-SUMO標(biāo)簽，純化得到帶有SBP-tag的蛋白，SBP-tag可以特異結(jié)合鏈親和酶素，它含有38個(gè)氨基酸，且其親和力強(qiáng)于strep-tag[17-18]。通過帶有鏈親和酶素的磁珠來篩選特異結(jié)合SBP-UP1的RNA文庫(kù)，具有結(jié)合UP1能力的RNA被篩選出來并通過反轉(zhuǎn)錄成cDNA，cDNA經(jīng)10–11輪的PCR擴(kuò)增，在PCR的過程中將測(cè)序的adapter和barcode加在cDNA的兩端，這樣構(gòu)建出可以用于高通量測(cè)序的文庫(kù)。傳統(tǒng)SELEX方法需要通過重復(fù)多輪的篩選，最后得到的只是親和力最高的motif，而且在PCR的過程中，會(huì)引入一些偏好性，而通過高通量測(cè)序方法，可以省去重復(fù)篩選的過程，并且通過數(shù)據(jù)分析，我們可以得到更多關(guān)于轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子靶位點(diǎn)的信息，而不僅僅是一段motif[8-9]。相信這一方法的建立對(duì)于今后發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的靶作用位點(diǎn)會(huì)有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α和BL21 (DE3) 由本實(shí)驗(yàn)室保存。pET28a-SUMO-SBP載體由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.1.2 主要試劑和耗材

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶和ssRNA ladder購(gòu)自New England Biolabs。DNA凝膠回收試劑盒、PCR清潔試劑盒購(gòu)自Axygen公司。T7 RNA polymerase由本實(shí)驗(yàn)室保存。5 mL HisTrap鎳柱、5 mL Heparin肝素親和層析柱、Superdex75 16/60凝膠過濾層析柱購(gòu)自GE。蛋白分子量marker購(gòu)自Thermo Scientific。DNA marker購(gòu)自TaKaRa公司。鏈霉親和素偶聯(lián)的Dynabeads和反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Invitrogen。超濾管購(gòu)自Millipore。透析袋購(gòu)自Spectrum。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和蛋白的表達(dá)純化

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建

以pET28a-SUMO-UP1 (1-196) 重組質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)引物UP1 F和UP1 R，引物兩端分別加RⅠ和Ⅰ酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增UP1 (1-196) 基因，引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

Table 1 Primer Sequences

*Restriction enzyme cutting site was underlined.

將UP1 (1-196) 亞克隆到pET28a-SUMO-SBP質(zhì)粒，室溫連接3 h。將pET28a-SUMO-SBP-UP1 (1-196) 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α，挑選陽(yáng)性克隆送上海睿迪生物公司測(cè)序。

1.2.2 蛋白的表達(dá)純化

將測(cè)序正確的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)，挑取克隆在5 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)6–8 h，再將菌液轉(zhuǎn)移至1 L LB培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)。當(dāng)菌液600達(dá)到0.6–0.8，降溫至18 ℃，加入終濃度0.2 mmol/L IPTG，18 ℃、200 r/min誘導(dǎo)16 h后收菌。

菌液重懸于buffer 1 (20 mmol/L Tris，pH 8.0，500 mmol/L NaCl，25 mmol/L 咪唑)，經(jīng)高壓破菌，17 000 r/min離心1 h，留上清，上樣至預(yù)先用buffer 1平衡的HisTrap柱，用buffer 2 (20 mmol/L Tris，pH 8.0，500 mmol/L NaCl， 500 mmol/L咪唑) 以梯度洗脫，收集目的峰，加入U(xiǎn)lp1酶切SUMO-tag，并在20 mmol/L Tris，pH 8.0，500 mmol/L NaCl的溶液中透析3 h，去除咪唑，再將樣品上樣至預(yù)先用buffer 1平衡的HisTrap柱，收集流穿液，Ulp1和6×His-SUMO-tag則結(jié)合在HisTrap柱上。將蛋白液的鹽濃度稀釋至100 mmol/L NaCl上樣到預(yù)先用buffer A (20 mmol/L Tris，pH 8.0，100 mmol/L NaCl) 平衡的Heparin柱，用buffer B (20 mmol/L Tris，pH 8.0，1 mol/L NaCl) 梯度洗脫，收集目的蛋白峰。目的蛋白經(jīng)超濾濃縮后上樣至預(yù)平衡的Superdex 75 16/60，對(duì)純化獲得的蛋白峰樣品取樣進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。平衡Superdex 75 16/60采用的緩沖液是10 mmol/L Tris，pH 7.5， 100 mmol/L NaCl，1 mmol/L DTT。

1.3 T7轉(zhuǎn)錄RNA template

將含有20個(gè)隨機(jī)序列的T7 template和T7 promoter (表2) 均稀釋至100 μmol/L，取等體積混勻，95 ℃退火5 min，參照冷泉港的T7轉(zhuǎn)錄體系[19]，37 ℃轉(zhuǎn)錄12 h，轉(zhuǎn)錄結(jié)束后加入DNase I消化DNA模板。利用16%的尿素PAGE膠純化RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。最終獲得的隨機(jī)RNA文庫(kù)濃度用Nanodrop2000定量。

1.4 SBP-UP1-RRM特異識(shí)別RNA文庫(kù)的構(gòu)建

取250 μL的結(jié)合緩沖液 (25 mmol/L Tris，pH 7.5，150 mmol/L KCl，3 mmol/L MgCl2，0.01% Tween20，1 mmol/L DTT，30 μg/mL polyI/C) 將SBP-UP1稀釋至250 nmol/L，冰上孵育30 min。然后加入終濃度為1 μmol/L的RNA隨機(jī)文庫(kù)和40 U RNase Inhibitor，冰上孵育1.5 h。同時(shí)，吸取100 μL Dynabeads用清洗緩沖液 (25 mmol/L Tris，pH 7.5，150 mmol/L KCl，0.5 mmol/L EDTA，0.01% Tween20) 清洗3次，每次200 μL，之后將Dynabeads平衡于200 μL的結(jié)合緩沖液中。將SBP-UP1和RNA文庫(kù)的混合物，與Dynabeads在室溫充分混合45 min，再加入1 mL的清洗緩沖液，洗去未結(jié)合SBP-UP1的RNA，然后將Dynabeads溶于洗脫緩沖液 (10 mmol/L Tris，pH 7.0，1 mmol/L EDTA，1% SDS)，70 ℃，10 min。洗脫下來的SBP-UP1和RNA復(fù)合物，通過苯酚/氯仿/異戊醇 (25∶24∶1) 抽提和乙醇沉淀，去除蛋白，得到被篩選出來RNA的文庫(kù)。特異識(shí)別UP1蛋白的RNA經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄和11輪的PCR擴(kuò)增，最終獲得可用于二代測(cè)序的文庫(kù)。為了文庫(kù)最終可用于二代測(cè)序，PCR引物含有可用于二代測(cè)序的adapter和barcode。PCR產(chǎn)物利用8% Native PAGE膠純化。整體實(shí)驗(yàn)流程如圖1所示，RT-PCR的引物序列見表2。

圖1 SELEX實(shí)驗(yàn)流程圖

表2 SELEX文庫(kù)構(gòu)建核酸序列

Table2 Oligonucleotides used for SELEX

*The barcode was underlined.

1.5 二代測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

二代測(cè)序文庫(kù)送至上海晶能生物公司，在Illumina HiSeq2500上測(cè)序，預(yù)計(jì)每個(gè)文庫(kù)測(cè)序得到2 000萬(wàn)條序列，參照Streaming kmer Analysis (SKA) 的方法分析數(shù)據(jù)[8]，該方法基于多輪讀出序列數(shù)據(jù)，持續(xù)更新相對(duì)識(shí)別參數(shù)，將每一個(gè)序列概率分配識(shí)別到一個(gè)特定kmer motif上，k=5–8。最終將每一個(gè)kmer的權(quán)重排序，得到優(yōu)先識(shí)別的RNA-motif。相對(duì)于傳統(tǒng)的尋找motif的方法MEME，SKA更適合運(yùn)用到SELEX的數(shù)據(jù)分析中，因?yàn)镾KA估算的是含有每一個(gè)motif的序列數(shù)，而不是在一組序列中顯著富集的motif。在本實(shí)驗(yàn)中，考慮到UP1含有2個(gè)RRM domain，因此計(jì)算k=8的優(yōu)先識(shí)別的RNA-motif。

1.6 SBP-UP1的體外結(jié)合試驗(yàn)

1.6.1 RNA oligo的化學(xué)合成

以3’-亞磷酰胺及2’-叔丁基二甲基硅 (TBDMS) 保護(hù)的核糖核酸為單體，以CPG為固相合成載體，在ABI 394 DNA/RNA synthesizer化學(xué)合成經(jīng)SELEX篩選得到的最優(yōu)RNA motif，合成的RNA oligo經(jīng)氨解和脫保護(hù)基，利用16%的尿素PAGE膠純化，最后將純化得到的RNA oligo用Nanodrop2000定量。

1.6.2 凝膠遷移實(shí)驗(yàn) (EMSA)

在10 μL的RNA oligo和SBP-UP1反應(yīng)體系中，底物RNA的終濃度固定為10 μmol/L，RNA和UP1以1∶0，1∶0.5，1∶1，1∶2及1∶4的比例混合，4 ℃反應(yīng)30 min，反應(yīng)buffer采用平衡superdex75 16/60的buffer。反應(yīng)結(jié)束后加入1 μL 100%甘油，進(jìn)行Native PAGE電泳。

2 結(jié)果與分析

2.1 SBP-UP1 (1-196) 的表達(dá)純化

將表達(dá)SBP-UP1的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，高壓破菌，收集破菌上清液。蛋白經(jīng)過HisTrap、Heparin和Superdex75純化而獲得，凝膠阻滯篩峰圖顯示SBP-UP1的出峰體積在59.9 mL，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室Superdex75 16/60標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，計(jì)算得到分子量為27 kDa (圖2A)，SDS-PAGE (圖2B) 顯示重組SBP-UP1位于27 kDa與理論分子量 (26 180 Da) 相符，且純度大于95%。

圖2 SBP-UP1的Superdex75 16/60凝膠阻滯峰圖 (A) 以及15% SDS-PAGE (B) 分析

2.2 T7 RNA轉(zhuǎn)錄文庫(kù)的鑒定

含有20個(gè)隨機(jī)堿基的RNA文庫(kù)理論大小在62 bp，經(jīng)16%尿素PAGE膠鑒定，T7體外轉(zhuǎn)錄所獲得RNA文庫(kù)與理論值相符。

圖3 RNA隨機(jī)文庫(kù)尿素PAGE膠分析

2.3 二代測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建

經(jīng)鏈親和酶素磁珠篩選獲得的特異識(shí)別SBP-UP1的RNA文庫(kù)，通過RT-PCR擴(kuò)增，所得PCR產(chǎn)物除了含有20個(gè)隨機(jī)堿基序列，隨機(jī)序列兩側(cè)還包含用于二代測(cè)序的adapter和barcode，產(chǎn)物大小為138 bp，Native PAGE膠 (圖4) 顯示PCR產(chǎn)物大小符合理論推測(cè)。經(jīng)PAGE膠純化所得DNA文庫(kù)送上海晶能生物公司測(cè)序。

圖4 SBP-UP1的SELEX文庫(kù)

2.4 二代測(cè)序數(shù)據(jù)分析

測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)去掉兩端adapter，得到1 950萬(wàn)條序列的數(shù)據(jù)量，再利用SKA算法分析含有 20個(gè)隨機(jī)序列的測(cè)序數(shù)據(jù)，設(shè)置k=8，將每一個(gè)8 mer motif的權(quán)重排序，獲得UP1結(jié)構(gòu)域最優(yōu)識(shí)別的RNA motif，5′-AGGCAGCA-3′。同時(shí)，通過分析SBP-UP1優(yōu)先識(shí)別的8條RNA motif (表3)，發(fā)現(xiàn)AGG和AG二種RNA序列出現(xiàn)的頻率最高，在這8條RNA motif中都存在，但是這兩種RNA序列兩側(cè)的序列是可變的、不確定的，因此可以推斷 UP1特異識(shí)別AGG和AG兩種保守RNA序列，而其余的序列則有一定的變化。

表3 SBP-UP1特異識(shí)別8 mer motif

Table 3 SBP-UP1 specifically binding of 8 mer motif

The consensus sequence was underlined.

2.5 EMSA驗(yàn)證SELEX結(jié)果

根據(jù)SELEX的結(jié)果，我們利用亞磷酰胺法化學(xué)合成了豐度最高的8 mer的RNA motif：5′–CCA–3′，EMSA的結(jié)果顯示UP1可以在體外結(jié)合5′–CCA–3′，且在UP1∶RNA=2∶1時(shí)，RNA都被UP1結(jié)合，幾乎看不到free-RNA，，因此通過EMSA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了經(jīng)SELEX結(jié)合二代測(cè)序技術(shù)篩選得到的UP1特異識(shí)別RNA motif可以與UP1在體外結(jié)合，也說明結(jié)合SELEX技術(shù)與二代測(cè)序技術(shù)篩選UP1特異識(shí)別RNA motif的方法是可行的。

圖5 SBP-UP1結(jié)合8 mer RNA的EMSA分析結(jié)果

3 討論

本研究將SELEX與二代高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)hnRNP A1的UP1結(jié)構(gòu)域最優(yōu)識(shí)別的RNA motifCCA，并通過EMSA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該motif與UP1在體外的特異性結(jié)合。經(jīng)過SKA算法的數(shù)據(jù)分析，我們不僅獲得了UP1的最優(yōu)識(shí)別的RNA motif，還獲得一些結(jié)合力稍弱的RNA motif，但在這些序列中AGG和AG二種RNA序列出現(xiàn)的頻率最高。由于UP1中含有兩個(gè)連續(xù)的RRM結(jié)構(gòu)域，所以我們推斷UP1的兩個(gè)RRM結(jié)構(gòu)域有可能分別傾向于特異性識(shí)別AGG和AG，這與通過傳統(tǒng)的SELEX方法獲得的motif UGA/U中的核心序列相同[16]。hnRNP A1蛋白通過識(shí)別不同的RNA底物參與microRNA的形成、mRNA的可變剪切等生物學(xué)過程[14-15]，其識(shí)別底物的序列也會(huì)有所差異，之前的研究從20 bp的隨機(jī)核酸文庫(kù)中，通過8輪篩選，獲得了hnRNP A1最優(yōu)識(shí)別的RNA motif[16]，而通過本研究我們可以發(fā)現(xiàn)結(jié)合力較弱的RNA motif，但是這些RNA motif的生物學(xué)意義還有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

本研究將UP1蛋白片段插入表達(dá)載體pET28a中，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-SUMO- SBP-UP1。SUMO-tag有利于蛋白的表達(dá)純化，在純化的過程中可以經(jīng)Ulp1酶切除，通過HisTrap柱、Heparin柱以及Superdex75的純化獲得純度在98%以上的SBP-UP1。SBP-tag則是用于SELEX體外篩選底物RNA，SBP-tag與鏈親和酶素有著較強(qiáng)的親和力，d=2.5 nmol/L[20]，通過帶有鏈親和酶素標(biāo)記的磁珠進(jìn)行篩選，由于磁珠易于洗滌及濃縮富集的優(yōu)點(diǎn)，可以提高篩選效率[21]。傳統(tǒng)的SELEX要經(jīng)過大概10輪左右的篩選才能獲得最適的RNA motif[22]，既耗費(fèi)時(shí)間也耗費(fèi)人力，而我們的方法只需經(jīng)過1輪篩選，便可得到蛋白特異識(shí)別的RNA文庫(kù)，再經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和PCR，在cDNA兩端加上用于二代測(cè)序的adapter和barcode，即可完成SELEX文庫(kù)的構(gòu)建，經(jīng)二代測(cè)序得到的高通量數(shù)據(jù)，用SKA算法加以分析，我們可得到蛋白特異識(shí)別的RNA motif。SKA算法被認(rèn)為是比MEME更適合于分析SELEX篩選的文庫(kù)數(shù)據(jù)，它是通過累計(jì)計(jì)算每一條kmer RNA在測(cè)序數(shù)據(jù)中的權(quán)重，將這些kmer RNA的權(quán)重進(jìn)行排序即可得到RNA motif的特異性的排序，SKA可以準(zhǔn)確分辨假陽(yáng)性的結(jié)果，提高數(shù)據(jù)分析的可靠性[8]。由于高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的通量大，信息量豐富，我們不僅可以發(fā)現(xiàn)RNA結(jié)合蛋白的最適底物，還可以發(fā)現(xiàn)結(jié)合力次優(yōu)的RNA motif，因?yàn)樵谏矬w內(nèi)RNA結(jié)合蛋白可能會(huì)通過結(jié)合不同的RNA發(fā)揮不同的功能[9-10]，這對(duì)于我們更全面地了解RNA結(jié)合蛋白的調(diào)控機(jī)制提供了更多的信息。

SELEX技術(shù)與高通測(cè)序技術(shù)的結(jié)合，使它具有優(yōu)于其他研究蛋白-RNA相互作用的研究方法的特點(diǎn)，可以通過測(cè)序數(shù)據(jù)的分析得到蛋白-RNA相互作用的更多信息。傳統(tǒng)的SELEX技術(shù)，通過多次循環(huán)篩選，最后可以得到親和力最高的靶序列，但是卻忽視了較弱的結(jié)合靶序列和蛋白R(shí)NA結(jié)合的特異性，且多輪篩選、PCR擴(kuò)增均會(huì)帶入序列偏好性。CLIP，是一種體內(nèi)篩選技術(shù)，它可以真實(shí)地反映蛋白與RNA相互作用在體內(nèi)的情況，但是這種技術(shù)難度高，且重復(fù)的篩選步驟和交聯(lián)的過程會(huì)引入序列的偏好性，后續(xù)的分析也很復(fù)雜，無法區(qū)別是單一蛋白的結(jié)合RNA motif還是蛋白復(fù)合物結(jié)合的RNA motif[23-24]。研究者通過比較SELEX技術(shù)和CLIP技術(shù)發(fā)現(xiàn)，SELEX技術(shù)所發(fā)現(xiàn)的motif，在CLIP中也有較高的信號(hào)。因此，新型的SELEX技術(shù)獲得的結(jié)果能夠一定程度反映體內(nèi)的情況，也可以一定程度糾正CLIP偏好性，并互補(bǔ)于CLIP技術(shù)[8]。

SELEX與高通量測(cè)序技術(shù)的結(jié)合將為RNA結(jié)合蛋白識(shí)別底物的特異性研究提供快速有效的方法，除了基礎(chǔ)生物學(xué)研究以外，該方法還可以應(yīng)用于更多核糖核酸結(jié)合分子識(shí)別特異性的研究，如生物分析、疾病診斷、治療、藥物篩選等方面。

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Screening specific recognition motif of RNA-binding proteins by SELEX in combination with next-generation sequencing technique

Lu Zhang, Jinhao Xu, and Jinbiao Ma

State Key Laboratory of Genetics, Department of Biochemistry, School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200438, China

RNA-binding protein exerts important biological function by specifically recognizing RNA motif. SELEX (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment), anselection method, can obtain consensus motif with high-affinity and specificity for many target molecules from DNA or RNA libraries. Here, we combined SELEX with next-generation sequencing to study the protein-RNA interaction. A pool of RNAs with 20 bp random sequences were transcribed by T7 promoter, and target protein was inserted into plasmid containing SBP-tag, which can be captured by streptavidin beads. Through only one cycle, the specific RNA motif can be obtained, which dramatically improved the selection efficiency. Using this method, we found that human hnRNP A1 RRMs domain (UP1 domain) bound RNA motifs containing AGG and AG sequences. The EMSA experiment indicated that hnRNP A1 RRMs could bind the obtained RNA motif. Taken together, this method provides a rapid and effective method to study the RNA binding specificity of proteins.

SELEX, next-generation sequencing, hnRNP A1, RNA motif

October 12, 2015; Accepted: December 11, 2015

張璐, 徐晉暤, 麻錦彪. 一種結(jié)合SELEX與二代測(cè)序技術(shù)篩選RNA結(jié)合蛋白特異識(shí)別序列新方法的建立. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(7): 966–974.

Zhang L, Xu JH, Ma JB. Screening specific recognition motif of RNA-binding proteins by SELEX in combination with next-generation sequencing technique. Chin J Biotech, 2016, 32(7): 966–974.

Corresponding author: Jinbiao Ma. Tel: +86-21-51630542; Fax: +86-21-51630541; E-mail: majb@fudan.edu.cn

(本文責(zé)編 陳宏宇)