周　麗， 胡春根

( 1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝林學(xué)學(xué)院， 教育部園藝植物生物學(xué)重點實驗室， 武漢 430070； 2. 興義民族師范學(xué)院， 貴州 興義 562400 )

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送春與多花蘭種間雜交后代的ISSR分析

周麗1，2， 胡春根1*

( 1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝林學(xué)學(xué)院， 教育部園藝植物生物學(xué)重點實驗室， 武漢 430070； 2. 興義民族師范學(xué)院， 貴州 興義 562400 )

該文使用簡單重復(fù)序列間(ISSR)分子標(biāo)記，對送春與多花蘭種間雜交后代進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：從80個ISSR引物中篩選出14個擴增效果穩(wěn)定的ISSR引物，對兩親本和59個F1代個體進(jìn)行了ISSR擴增，得到107個擴增位點，擴增的片段大小位于90～2 100 bp之間，平均每個引物擴增7.64條條帶，得到11種類型的帶。ISSR標(biāo)記在送春 × 多花蘭的F1代中表現(xiàn)出一定的多態(tài)性，分離頻率為44.86%，分離位點有83.33%符合孟德爾1∶1或3∶1的分離規(guī)律，產(chǎn)生偏孟德爾分離的位點占12.50%，余下的4.17%屬于特殊分離帶型?？赡軐?dǎo)致后代變異的位點為偏孟德爾分離的6條帶、缺失的8條帶或新生成的2條帶。聚類圖中父本和母本與F1代個體間的遺傳距離較遠(yuǎn)，59個雜交后代先聚集成一組，再同母本相聚為一組，最后才同父本聚在一起，59個雜種均偏母本型。送春與多花蘭的雜交后代在植株形態(tài)、染色體、遺傳物質(zhì)方面都具備雙親特點，61個個體間的ISSR分子量標(biāo)記結(jié)果和植株形態(tài)學(xué)特征都說明，59個F1代雜種包含送春和多花蘭的遺傳特性是真雜種；F1代雜種既有雙親的互補特征帶，又有雙親的重組片斷即產(chǎn)生新的特異帶，這說明送春與多花蘭的雜交后代具有遺傳變異的特點。該研究結(jié)果可以有效地對雜交后代進(jìn)行定向選擇，為蘭花的雜交育種提供了分子依據(jù)。

送春, 多花蘭, 種間雜種, ISSR分子量標(biāo)記, 孟德爾分離, 聚類分析

送春(Cymbidiumcyperifoliumvar.szechuanicum)，又名綠蘭、春綠蘭，為蘭科(Orchidaceae)蘭屬(CymbidiumSW.)的重要觀賞植物。送春開花時間2-4月，具花9～12朵，花香淡雅，在春蘭花期過后的晚春時節(jié)送來縷縷清香。但送春花色不亮、葉薄革質(zhì)、易外彎，欲改良這些性狀，用多花蘭(C.floribundum)與送春雜交，使相關(guān)性狀互補，可選育出新的雜交品種。然而，由于國蘭類經(jīng)種子繁育的試管苗從栽培到開花所需時間較長。因此，通過對兩親本及F1代的分子標(biāo)記， 探尋雜交后代的遺傳規(guī)律，為其雜種后代的鑒定提供早期分子輔助選擇依據(jù)。

ISSR分子標(biāo)記是在SSR標(biāo)記基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，現(xiàn)已形成成熟的技術(shù)，具有操作簡便、重復(fù)性好等特點，可揭示比RFLP、RAPD、SSR更多的多態(tài)性，在遺傳作圖、基因定位、遺傳多樣性分析、進(jìn)化、系統(tǒng)發(fā)育等研究方面被廣泛應(yīng)用(王健波，2002)。前人采用ISSR標(biāo)記對多種物種的遺傳多樣性進(jìn)行標(biāo)記，如束花石斛(包音華等，2008)、華頂杜鵑(顏士輝等，2012)、夏蠟梅(汪瓊等，2013)、太行菊(張世安等，2014)、油茶(考安都等，2014)。

1　材料與方法

1.1 材料

以送春為母本，多花蘭為父本，得到雜交F1代果實，采用組培播種方法得到F1代59個個體(確保每個來源于一粒種子)，F(xiàn)1代材料直接從組培瓶中取出，兩親本取幼嫩葉片，所有備用材料在超低溫冰箱保存。引物參照加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的ISSR引物序列合成，購自上海生工；Taq酶、dNTP、Mg2+購自天根生化科技(北京)有限公司；Marker DL2000購自西寶生物公司。

1.2 方法

用改良CTAB法提取各材料總DNA。20 μL反應(yīng)體系各組分的濃度分別為 1 × PCR buffer(不含Mg2+)，2.5 mmol·L-1Mg2+，0.25 mmol·L-1dNTPs，Taq DNA聚合酶1 U，引物 0.6 μmol·L-1， Template DNA 2.5 ng·μL-1，去離子甲酰胺2%。ISSR-PCR擴增程序為94 ℃預(yù)變性5 min 1個循環(huán)；94 ℃變性35 s，47～58 ℃(依引物不同而不同)退火45 s，72 ℃ 延伸90 s 共40個循環(huán)；72 ℃保溫10 min 1個循環(huán)，保存溫度4 ℃。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠分離，TBE(1×)緩沖液，120 V電泳2 h，EB液染色10 min。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

從擴增結(jié)果中選擇多態(tài)性好的清晰條帶進(jìn)行分析，在電泳圖譜中同位點上有條帶的記為“1”，無帶的記為“0”，建立(0，1)矩陣。用NTsys-pc2.02軟件進(jìn)行Nei’s遺傳相似系數(shù)計算并UPGMA法構(gòu)建聚類樹狀圖，根據(jù)駱建霞和孫建設(shè)的方法進(jìn)行分離符合度的卡平方測試。

2　結(jié)果與分析

2.1 ISSR引物的篩選

參考前人所使用的引物(高麗和楊波，2006)，從80條ISSR引物中篩選出擴增結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性強、條帶清晰、多態(tài)性高的14條引物并優(yōu)化退火溫度(表1)。用這些引物對61份材料進(jìn)行PCR擴增。

表 1　ISSR引物序列、最佳退火溫度及統(tǒng)計位點數(shù)

Y=(C,T)

2.2 PCR擴增結(jié)果

14條ISSR引物總共擴增出107條帶，每個引物平均擴增產(chǎn)生7.64條帶，所得片段大小為90～2 100 bp，ISSR標(biāo)記在兩親本和雜交子代中表現(xiàn)出多態(tài)性(圖1)。

擴增結(jié)果可分為11種類型 (表2)，后代分離方式(表5)， 雙親共有型(兩親本和后代中全都有的帶，這樣的位點是兩親本共有且能在后代中完全遺傳) ，這表明在兩親本中該位點以純結(jié)合方式存在；偏父本型 (父本有母本無，后代中全有)，說明該位點在父本中是純結(jié)合的，在后代中沒有發(fā)生分離；偏母本型 (母本有父本無，后代中全有)，說明該位點在母本中是純結(jié)合的，在后代中沒有發(fā)生分離；以上3類帶共計50條，占總帶數(shù)的46.73%， 它們是在雜交后代中未發(fā)生等位基因分離的位點。缺失型帶有8條，占總帶數(shù)的7.48%，表現(xiàn)為雙親缺失型(兩親本有，后代中全無)、母本缺失型(母本有父本無，后代中全無)、父本缺失型(母本無父本有，后代中全無)，產(chǎn)生缺失型帶，可能是染色體重組或斷裂導(dǎo)致親本特征譜帶丟失。分離型帶有47條，占總帶數(shù)的43.92%，表現(xiàn)為母本分離型、父本分離型共、雙親分離型(兩親本有，后代中出現(xiàn)分離)，分離位點中，有38個符合孟德爾的分離中等位基因1∶1分離模式，有2個符合3∶1分離模式(表3)， 有6個偏離孟德爾遺傳模式，分離方式既不是3∶1也不是1∶1，另有1個特殊位點在兩親本中均存在但是在交雜的F1代中，卻有近一半的個體中有條帶出現(xiàn)，屬于特殊的雙親分離型。新生雜合型(兩親本無，后代中全有) 、新生雜合分離型(兩親本無，后代中分離出現(xiàn))各有1條帶占總帶數(shù)的1.87%，2新增位點可能包含重組片斷，這表明在F1代中可能產(chǎn)生新的變異。

ISSR標(biāo)記在送春與多花蘭雜交后代中表現(xiàn)多態(tài)性，并遵循呈孟德爾分離規(guī)律(表3)。ISSR為顯性標(biāo)記(有帶為顯性，沒有帶為隱性)，在雜交后代沒發(fā)生分離的50條帶型中，雙親共有標(biāo)記有21條，有11條是父本特有標(biāo)記，18條是母本特有標(biāo)記，說明這些是沒有發(fā)生遺傳分離的位點，其雜交親本的可能基因型組合為AA×AA、AA×Aa、Aa×AA、AA×aa、aa×AA五種類型之一；符合孟德爾分離的位點有40個，占總位點數(shù)的37.38%，其中符合1∶1分離比例的有38個位點，其親本基因型可能為Aa×aa或aa×Aa，有2條符合3∶1分離比例，但父本為顯性(有條帶)母本為隱性(無條帶)，親本基因型無法推斷；有6個單親特有的位點，在后代中發(fā)生了偏孟德爾遺傳分離，分離比例既不符合1∶1又不符合3∶1，細(xì)胞質(zhì)遺傳有可能導(dǎo)致擴增位點中產(chǎn)生不符合孟德爾遺傳現(xiàn)象(表4)。

送春與多花蘭雜交后代具備雙親的特征，ISSR分子標(biāo)記結(jié)果和植株形態(tài)學(xué)特征都說明59個 F1代雜種包含雙親的遺傳特性是真雜種；標(biāo)記得到的位點分析結(jié)果表明，發(fā)生分離的位點母本特有標(biāo)記要比父本特有標(biāo)記多，不分離位點母本特有標(biāo)記的也要比父本特有標(biāo)記多，說明大多數(shù)雜種性狀偏向母本；雜交后代不但保留著雙親的互補特征帶，而且生成了新的重組片斷帶型，說明送春與多花蘭的雜交后代既有遺傳又有變異。

表 2　擴增結(jié)果統(tǒng)計

2.3 聚類分析

利用UPGMA法對兩親本及59個雜種進(jìn)行ISSR聚類分析(圖2)。從圖2可以看出，59個雜交后代先聚集成一組，再同母本相聚為一組，最后才同父本聚在一起，59個雜種均偏母本型，表明了大多數(shù)雜種性狀偏向母本。

用NTsys-pc2.02軟件計算親本與雜交后代的遺傳距離和遺傳一致度，F(xiàn)1代與送春的遺傳相似系數(shù)在0.628 6～0.756 8之間，其中遺傳相似系數(shù)大于0.7的有24個；F1代與多花蘭的遺傳相似系數(shù)在0.590 9～0.711 1之間， 其中大于0.7的僅有3個F1代個體；59個雜種間的遺傳一致度高，在0.773 3～0.934 2間，聚類時最先聚在一起是雜種11號和26號，它們的遺傳相似系數(shù)達(dá)0.934 2，為最高；兩親本間的遺傳一致度最低僅為0.333 3。送春和多花蘭的遺傳距離為0.666 7為最遠(yuǎn)，兩者在花朵數(shù)、花色、葉姿等方面存在明顯差異，在F1代中容易表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢。F1代的遺傳特性介于兩親本之間，各個F1代個體間的遺傳距離較小。

3　討論與結(jié)論

在遠(yuǎn)緣雜交中，大多數(shù)雜種是偏母本性狀的(陳瑞丹和張啟翔，2004)。雜交育種時因重組而導(dǎo)致部分同源染色體間產(chǎn)生大量錯配，使雜交后代保留大量重組體，接著重組分離和染色體斷裂，導(dǎo)致染色體序列變化；細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的相互作會也會影響基因組變化，雜交時為了達(dá)到核質(zhì)平衡，細(xì)胞質(zhì)會對外源核基因提供部分選擇壓力。偏父性遺傳的基因主要位于線粒體基因組上，其原因是葉綠體基因組受到較嚴(yán)格的約束混雜的DNA量少，線粒體基因組混雜的DNA量比較多(戴思蘭，2005)。

表 3　符合孟德爾分離位點的卡平方分析

表 4　偏孟德爾分離和兩個特殊分離位點的卡平方分析

表 5　ISSR標(biāo)記在送春×多花蘭F1代的分離方式

送春屬于蘭屬建蘭組，地生蘭，假鱗莖較小，葉8～16片，薄革質(zhì)易彎垂，花9～12朵；多花蘭屬于蘭屬硬葉組，附生蘭，假鱗莖較大，葉5～6枚，帶形，堅紙質(zhì)直挺，花無香味，10～40朵。父本和母本在植物學(xué)形態(tài)上差異很顯著，其F1代種子萌發(fā)后不像地生蘭一樣形成根狀莖也不像附生蘭那樣形成原球莖，而是形成類似根狀莖的原球莖，并且分化后，在根莖以下部分仍然存有根狀莖結(jié)構(gòu)。F1試管苗栽培后大部分性狀是趨母本的，在葉片寬度、葉片硬度、葉脈是否透明、有無葉關(guān)節(jié)、葉緣的情況等方面的表現(xiàn)介于兩親本之間，另外還有極少數(shù)葉尖有裂缺或葉緣白化形成葉藝的，可能是突變產(chǎn)生或是親本祖先類型。

圖 1　電泳照片　a. 引物 UBC857擴增結(jié)果; b. 引物UBC835擴增結(jié)果; c. 引物UBC818擴增結(jié)果; d. 引物UBC836擴增結(jié)果; M. 分子量標(biāo)記; FP. 母本; MP. 父本; CK. 對照; 1-21. F1代小苗。Fig. 1　Photos of electrophoresis　a. Primer UBC857; b. Primer UBC835; c. Primer UBC818; d. Primer UBC836; M. Marker; FP. Female plant; MP. Male plant; CK. Negative control without template DNA; 1-21. F1 progeny plantlets.

圖 2　親本及雜種的ISSR聚類分析樹狀圖FP. 母本； MP. 父本； 1-59. F1小苗。Fig. 2　Dendrogram for parent and hybrid progenies by cluster analysis(UPGMA)bases on ISSR markers　FP. Female plant; MP. Male plant; 1-59. F1 progeny.

偏孟德爾分離產(chǎn)生的原因可能是由于群體大小所致，但本實驗所取樣群體中的有個40位點卡平方分析結(jié)果表明符合孟德爾分離，可以排除群體因素造成的偏孟德爾分離；如果是由于染色體發(fā)生結(jié)構(gòu)重排、缺失、插入和突變或雙親配子傳遞率的差異等原因造成偏孟德爾分離，則有可能產(chǎn)生突變，得到可選育新品種的新資源；如果是不同樣本之間標(biāo)記的清晰度差異引起的誤差導(dǎo)致偏孟德爾分離產(chǎn)生，該位點則無效。缺失帶型則有可能是染色體在雜交后分裂時發(fā)生了染色體缺失， 造成缺失帶型的原因可能是由于雙親在染色體共線性上的差異導(dǎo)致形成“發(fā)卡”式結(jié)構(gòu)而丟失，或是反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的激活等原因，具體原因有待進(jìn)一步深入研究；新生帶型發(fā)生的可能性是很小的，僅有2條，其產(chǎn)生的原因可能是染色體中插入新的片段或是染色體突變，可采用SRAP或SCoT標(biāo)記進(jìn)一步探究。

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ISSR analysis of interspecific hybrids descendants ofCymbidiumcyperifoliumvar.szechuanicumandC.floribundum

ZHOU Li1,2, HU Chun-Gen1*

( 1.HuazhongAgriculturalUniversityCollegeofHorticulture&ForestryScience,KeyLaboratoryofHorticulturalPlantBiologyMinistryofEducation, Wuhan 430070, China; 2.XingyiNormalUniversityforNationalities, Xingyi 562400, China )

Interspecific hybrids descendants ofCymbidiumcyperifoliumvar.szechuanicumandC.floribundumwere studied by using ISSR marker. Fourteen ISSR primers were selected from 80 ISSR primers, which were used to amplify 61 individuals including paternal, maternal and 59 F1 progeny, 107 DNA fragments were produced by using these ISSR primers to amplify, every primer had 7.64 bands in average. The length of amplified DNA fragments ranged from 90 bp to 2 100 bp, and there were 11 kinds of bands. The results showed that the polymorphism of ISSR marker in the F1 progenies was high, and the segregation locus was 44.86%. And 83.33% segregation loci accorded with the segregation patterns of Mendelian segregation model with the segregation ratio nearly 1∶1 or 3∶1. 12.50% segregation loci deviated from Mendelian segregation model, 4.17% segregation loci belonged to special bands. Six deviated from Mendelian segregation model bands, eight deficiency bands and two new genetic character bands would cause some new variation. Cluster analysis showed that the genetic distances of both parental and 59 F1 progeny is further, fifty-nine F1 progeny in one group, then fifty-nine F1 progeny and female plant were in one group, at last 59 F1 progeny and female plant and male plant were in one group, this result indicated that 59 hybrids were partial female type. The hybrids ofCymbidiumcyperifoliumvar.szechuanicumandC.floribundumhad some common characteristics of their parents, such as leaves, chromosomes and hereditary material. Sixty-one materials were identified by ISSR markers and morphological characters that 59 F1 progeny obtained the genetic characteristics ofCymbidiumcyperifolimvar.szechuanicumandC.floribundum, so they were true hybrids. Fifty-nine F1 hybrids had mutually complementary bands of both parents, the F1 hybrids also produced some new specific bands which were recombinant fragment of parents. This experiment showed that 59 F1 progeny had both genetic and variation. Therefore, ISSR markers can be used as an effective molecular technique for directional selection of the interspecific hybrid and the study of orchid cross-breeding.

Cymbidiumcyperifoliumvar.szechuanicum,Cymbidiumfloribundum, interspecific hybrid, ISSR markers, Mendelian segregation, cluster analysis

10.11931/guihaia.gxzw201412019周麗， 胡春根. 送春與多花蘭種間雜交后代的ISSR分析 [J]. 廣西植物， 2016， 36(8):949-955

ZHOU L, HU CG. ISSR analysis of interspecific hybrids descendants ofCymbidiumcyperifoliumvar.szechuanicumandC.floribundum[J]. Guihaia， 2016， 36(8):949-955

2014-12-13

2015-02-29

貴州省教育廳項目 [2011(278)號] [Supported by the Program of Education Office of Guizhou Province 2011(278)]。

周麗(1978-)，女,貴州興義人,碩士,副教授, 從事蘭科植物保育與種質(zhì)創(chuàng)新研究，(E-mail)zhouli@xynun.edu.cn。

*通訊作者： 胡春根，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事果樹重要經(jīng)濟性狀相關(guān)基因克隆與轉(zhuǎn)基因遺傳改良研究，(E-mail)chungen@mail.hzau.edu.cn。

Q943，Q341

A

1000-3142(2016)08-0949-07