楊雅蕓，陳琳，許小敏，梁珊燕，王春萍

重癥醫(yī)學(xué)科患者主動(dòng)篩查分離的耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌獲得性耐藥基因及遺傳標(biāo)記檢測

楊雅蕓，陳琳，許小敏，梁珊燕，王春萍

目的 了解寧波地區(qū)6家三級(jí)醫(yī)院成人ICU患者主動(dòng)篩查分離的耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中獲得性耐藥基因與可移動(dòng)遺傳元件的存在狀況。方法 采用主動(dòng)篩查ICU患者收集菌株，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）及序列分析檢測獲得性耐藥基因與可移動(dòng)遺傳元件，GN-16藥敏卡及K-B法測定藥物的敏感性。結(jié)果 40株不動(dòng)桿菌對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率27.5%，替加環(huán)素耐藥率25.0%，其他常見抗菌藥物耐藥率均為100%。檢出 -內(nèi)酰胺酶TEM、ADC、OXA-2群、OXA-23、OXA-24、OXA-66等6種基因，ADC、OXA-2群、OXA-23、OXA-66檢出率均達(dá)100.0%。檢出氨基糖苷類修飾酶基因aac(3)-Ⅰ、aac(6')-Ⅰb、ant(3")-Ⅰ、aph(3')-Ⅰ和armA 16SrRNA甲基化酶基因，陽性率均低于25.0%?？梢苿?dòng)遺傳元件遺傳標(biāo)記中IS26、ISaba1檢出率均達(dá)100.0%。intⅠ1、tnpU檢出率均為25.0%。連鎖檢測ISaba1-ADC、ISaba1-OXA-23陽性率均為100.0%，而ISaba1-OXA-66均呈陰性。獲得性耐藥基因OXA-2群、OXA-23、OXA-66及ADC與MGEs遺傳標(biāo)記IS26、ISaba1高度相關(guān)。結(jié)論 6家三級(jí)醫(yī)院篩查分離不動(dòng)桿菌耐藥嚴(yán)重，獲得性耐藥基因與可移動(dòng)遺傳元件遺傳標(biāo)記存在高度相關(guān)。

耐藥不動(dòng)桿菌；獲得性耐藥基因；可移動(dòng)遺傳元件

鮑曼不動(dòng)桿菌具有強(qiáng)大的獲得性和克隆傳播的能力，重癥醫(yī)學(xué)科（ICU）鮑曼不動(dòng)桿菌表現(xiàn)出高度的耐藥性。為了解寧波地區(qū)成人ICU患者ASC耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的 -內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類藥物和其他藥物的獲得性耐藥基因與可移動(dòng)遺傳元件（MGEs）遺傳標(biāo)記存在狀況，以及這些獲得性耐藥基因與MGEs的關(guān)系。筆者對(duì)40株耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行了55種 -內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類藥物和其他藥物的獲得性耐藥基因，13 種MGEs的遺傳標(biāo)記檢測，并對(duì)檢測結(jié)果作了指標(biāo)聚類分析系；同時(shí)為了探討部分 -內(nèi)酰胺酶基因與MGEs的關(guān)系，作 了 ISaba1-ADC、ISaba1-OXA-23、ISaba1-OXA-66連鎖檢測，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2013年1—12月入住寧波市第一醫(yī)院、寧波市第二醫(yī)院、寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院3家三甲醫(yī)院和寧波市鄞州人民醫(yī)院、寧波市北侖人民醫(yī)院、寧波市第六醫(yī)院3家三乙院ICU時(shí)間＞48 h患者。入住ICU后第1天患者進(jìn)行肛拭子采樣，法國bioMerieux公司顯色培養(yǎng)基篩查，共收集40株菌株。

1.2 菌種鑒定及藥敏試驗(yàn) 菌種鑒定先用法國生物梅里埃公司全自動(dòng)微生物鑒定儀作初步篩查，繼而進(jìn)一步作gyrA基因擴(kuò)增測序（gyrA 引物 P1：5’-AAATCTGCCCGTGTCGTTGGT-3’；P2：5’-GCCATACCTACGGCGATACC-3’，測得序列與BLASTn比對(duì)。藥敏試驗(yàn)為VITEK2及K-B法，抗菌藥物敏感性判斷根據(jù)2014CLSI進(jìn)行。

1.3 細(xì)菌DNA模板制備 蛋白酶K裂解法。

1.4 基因檢測 全部基因檢測均為聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法，完全按照試劑盒說明書操作。檢測項(xiàng)目：（1）-內(nèi)酰胺類藥物獲得性耐藥基因。TEM、SHV、CTXM-1群、CTX-M-2群、CTX-M-3群、CTX-M-9群、CTX-M-25群、PER、VEB、GES、CARB、RTG、KPC、SCO、IMP、VIM、SIM、SPM、GIM、AIM、NDM、KHM、DIM、TMB、ADC、DHA、OXA-1群、OXA-2群、OXA-10群、OXA-23群、OXA-24群、OXA-51群、OXA-58群。（2）氨基糖苷類獲得性耐藥基因。aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、aac(6')-Ⅰad、aac(6')-Ⅰb、aac(6')-Ⅱ、ant(2")-Ⅰ、ant(3")-Ⅰ、ant (4')-Ⅰ、aph3'-Ⅰ、armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、npmA。（3）其他藥物獲得性耐藥基因。qepA、qnrA、qnrB、qnrS、aac (6')-Ⅰb-cr、adeB、qacE△1。（4）MGEs的遺傳標(biāo)記。traA、trbC、intⅠ1、intⅠ2、intⅠ3、tnpU、tnp513、IS26、IS903、ISaba1、ISaba4、ISaba9、merA。（5）連鎖檢 測 基 因。ISaba1-ADC、ISaba1-OXA-23、ISaba1-OXA-66。

1.5 陽性基因測序和聚類分析 PCR產(chǎn)物用ABI公司3730（美國）全自動(dòng)熒光法測序。用Chromas直接作BLAST Search網(wǎng)上比對(duì)。UPGMA法作指標(biāo)聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 藥敏檢測結(jié)果 40株耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)替加環(huán)素敏感率50.0%，頭孢哌酮/舒巴坦敏感率12.5%，中敏率60.0%，對(duì)其他常用抗菌藥物均耐藥。見表1。

表1 40株耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)常用抗菌藥物的敏感率 株（%）

2.2 基因檢測結(jié)果 -內(nèi)酰胺酶TEM、ADC、OXA-2群、OXA-23、OXA-66檢出率100.0%，OXA-24檢出率5.0%。氨基糖苷類獲得性耐藥基因aac(3)-Ⅰ檢出率15.0%，aac(6')-Ⅰb檢出率25.0%，ant (2")-Ⅰ檢出率20.0%，aph(3')-Ⅰ、armA 16SrRNA甲基化酶基因檢出率25.0%；MGEs遺傳標(biāo)記intⅠ、tnpU1、tnp513檢出率 25.0%，IS26、ISaba1檢出率100.0%；連鎖檢測ISaba1-ADC、ISaba1-OXA-23檢出率100.0%，ISaba1-OXA-66未檢出；其他藥物獲得性耐藥基因adeB檢出率100.0%，qacE△1檢出率25.0%。

2.3 檢測基因結(jié)果的指標(biāo)聚類分析獲得性耐藥基因 OXA-2群、OXA-23、OXA-66及ADC、adeB與MGEs遺傳標(biāo)記IS26、ISaba1高度相關(guān)。

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌的整合子、轉(zhuǎn)座子（含插入序列）和接合性質(zhì)粒等MGEs能將自身的整合酶基因、轉(zhuǎn)座酶基因、接合（性毛）基因以及所攜帶的耐藥基因在同種細(xì)菌不同菌株之間和不同種細(xì)菌菌株之間傳播，從而使其所攜帶的耐藥基因快速播散[1]。所以ICUASC耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌陽性者，在接下來的住院期間更易發(fā)生該細(xì)菌的感染，需要對(duì)患者進(jìn)行床旁的接觸隔離。

本組菌株獲得性耐藥基因檢測顯示，-內(nèi)酰胺酶 ADC、OXA-2群、OXA-23、OXA-24及OXA-66等基因的高檢出率與包括亞胺培南和美洛培南在內(nèi)的頭孢類藥物高耐藥率一致；氨基糖苷類修飾酶基因和armA 16SrRNA甲基化酶基因的檢出率與氨基糖苷類藥物耐藥率一致。連鎖檢測ISaba1-ADC、ISaba1-OXA-23均呈陽性。連鎖檢測進(jìn)一步驗(yàn)證了ADC-67和OXA-232種 -內(nèi)酰胺酶基因均由插入序列 ISaba1介導(dǎo)。并由ISaba1-ADC-67、ISaba1-OXA-23測序圖ISaba1的IRL區(qū)可見，兩者有一個(gè)堿基差別。這與文獻(xiàn)報(bào)道相同[2-3]。ISaba1-ADC-67、ISaba1-OXA-23兩者有一個(gè)堿基差別又說明菌株擁有 2個(gè)不同的ISaba1拷貝（它們的IRL區(qū)不同）。

由于轉(zhuǎn)座子、插入序列自帶啟動(dòng)子導(dǎo)致相鄰基因的高表達(dá)[4-6]。本文的連鎖檢測 ISaba1-ADC-67、ISaba1-OXA-23均呈陽性，并提示ADC-67和OXA-23 2 種 -內(nèi)酰胺酶基因有可能高表達(dá)。對(duì)耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行 ISaba1-ADC-67、ISaba1-OXA-23、ISaba1-OXA-66連鎖檢測國內(nèi)為首次。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.01.018

R446.6

A

1671-0800(2016)01-0035-03

2015-08-20（本文編輯：孫海兒）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014KYA197）；寧波市科技局社發(fā)擇優(yōu)委托項(xiàng)目（2011C51002）

315010寧波，寧波市第二醫(yī)院

許小敏，Email:xjl19990 802@sina.com