趙新，劉娜，陳銳，王成，朱珠，王永，蘭青闊（天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，天津300381）

應(yīng)用通用引物量化檢測鮮肉及其制品中羊源性成分

趙新，劉娜，陳銳，王成，朱珠，王永，蘭青闊*
（天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，天津300381）

分別以牛、羊、豬、雞、鴨、馬線粒體細(xì)胞色素b基因為研究對象，設(shè)計羊源性成分特異性引物和探針，同時結(jié)合實時熒光定量PCR技術(shù)，引入16SrDNA內(nèi)參基因校正羊種屬特異性基因測定方法，建立快速、高通量的鮮肉及鮮肉制品中羊源性成分確證方法，實現(xiàn)科學(xué)準(zhǔn)確的食品摻假量化判定技術(shù)體系。通過特異性、通用性及模擬混合樣品的檢測，對所建立方法進行驗證。結(jié)果表明：建立的羊源性成分含量測定方法具有良好的特異性和通用性，且通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系均達0.996以上；通過羊種屬特異性基因與16SrDNA內(nèi)參基因Quantity值及校正系數(shù)，可以計算出樣品中所含羊源性成份的質(zhì)量百分比含量，經(jīng)模擬混合樣品的檢測，回收率平均值到達96.25%，說明量化研究結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確性。

16SrDNA內(nèi)參基因；外源種屬特異性基因；羊源性成分；量化檢測

多源化的肉類品種是人們餐桌文化日趨豐富的重要組成部分，然而隨著市場上牛羊肉價格的不斷大幅上漲，部分不法企業(yè)及商販，為了自身經(jīng)濟利益的最大化，在高成本的牛肉或羊肉中摻入低廉的其他肉類品種進行銷售。隨著歐洲“馬肉風(fēng)波”丑聞的不斷發(fā)酵，愛爾蘭、荷蘭、羅馬尼亞等多個國家卷入其中，歐盟食品標(biāo)簽制度的權(quán)威性受到嚴(yán)重挑戰(zhàn)，歐洲消費者對食品產(chǎn)業(yè)的信心大大降低［1-3］。我國公安部近日公布了多起假牛羊肉、病死肉、有毒有害肉制品案件，嚴(yán)重危害了人民健康、擾亂和破壞了市場秩序和社會安定。

目前對于動物源性成分的鑒定方法，無論是國標(biāo)方法還是商檢方法均不完善，傳統(tǒng)的感官和化學(xué)方法耗時長、操作繁瑣、且不能量化，而實時熒光定量PCR技術(shù)等最常用的分子生物學(xué)方法［4-5］大多數(shù)仍停留在用定量的方法作為定性判定的指標(biāo)，缺乏真正意義上的量化技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，致使市場監(jiān)管部門無法依據(jù)摻假輕重情節(jié)（即摻假量化數(shù)值）針對性地進行處罰和治理［6-8］。因此，基于以上市場背景，迫切需要一種快速、精準(zhǔn)、量化的肉類鑒別方法。

實時熒光定量PCR技術(shù)相對于傳統(tǒng)的感官、化學(xué)等方法存在相對優(yōu)勢，但要想將實時熒光定量PCR技術(shù)發(fā)展成為動物源性成分量化判定的一種有效方法，必須消除待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品間因DNA斷裂程度引起的偏差，而內(nèi)參基因的引入對肉源品種的整體DNA損傷程度和提取效率進行監(jiān)控，校正種屬特異性基因百分含量，消除量值結(jié)果偏差，獲得真實可信的食品摻假數(shù)值，有效提高檢測方法的靈敏度和準(zhǔn)確性［9-10］。

本研究采用牛、羊、豬、雞、鴨、馬等常見肉源品種的線粒體DNA細(xì)胞色素b（Cytb）基因和16SrDNA內(nèi)參基因為研究對象，旨在運用實時熒光定量PCR技術(shù)結(jié)合內(nèi)參基因去除樣品在DNA斷裂以及提取效率上可能與標(biāo)準(zhǔn)品存在的差異，對羊種屬特異性基因的量值判定進行校正，建立科學(xué)、快速、精準(zhǔn)的鮮肉及鮮肉制品中羊源性成分確證及量化判定標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)體系，為市場規(guī)范與監(jiān)管提供科學(xué)可靠的技術(shù)手段。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

牛肉、羊肉、豬肉、雞肉、鴨肉、馬肉、驢肉、鯽魚、大豆粉：均購于天津市農(nóng)貿(mào)市場；羊源性成分（100%）標(biāo)準(zhǔn)品：購于遼寧出入境檢驗檢疫局；動物基因組提取試劑盒：天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所動植物分子鑒定實驗室研制；Premix Ex Taq（Probe qPCR）預(yù)混液：TaKaRa公司；引物、探針：由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

StepOnePlus Real-time PCR儀：美國ABI公司；ND-1000 NanoDrop核酸蛋白測定儀：美國Bio-Rad公司；Allegra 21R Centrifuge高速冷凍離心機：美國BECKMAN公司。

1.2試驗方法

1.2.1引物與探針的設(shè)計

根據(jù)NCBI等網(wǎng)站中公布的不同物種16SrDNA基因序列，選取物種間序列保守區(qū)域運用引物設(shè)計軟件Beacon Designer 7設(shè)計通用引物和探針。再同時參照文獻［11］，對不同物種線粒體DNA細(xì)胞色素b基因序列進行比對分析，選取物種間序列變異大的區(qū)域設(shè)計特異性引物和探針。引物和探針由上海生工生物工程有限公司合成，引物和探針序列見表1。

表1PCR和測序引物序列Table 1　PCR and sequencing primers sequence

1.2.2DNA模板的提取

取100 mg放入2 mL離心管，參照本實驗室研制的動物基因組提取試劑盒方法提取基因組DNA，在NanoDrop核酸蛋白測定儀中進行核酸含量的測定。也可用其他等效動物基因組提取試劑盒提取基因組DNA。

1.2.3PCR反應(yīng)條件的建立

PCR反應(yīng)體系為20 μL，各成分含量為：2×Premix Ex Taq（Probe qPCR）預(yù)混液 10 μL，上下游引物各1 μL，探針引物0.5 μL，模板2 μL（模板濃度50 ng/μL）無菌超純水補足20 μL，混勻后離心，在實時熒光PCR儀上開始循環(huán)。循環(huán)參數(shù)為：95℃預(yù)變性15 min，然后進行45個循環(huán)，每個循環(huán)為95℃變性20 s，62℃退火30 s。

1.2.4方法特異性檢測

用羊種屬特異性基因引物擴增9種動物源性樣品（牛、羊、豬、雞、鴨、馬、驢、鼠、狗）及其他一些非動物源性樣品（水稻混合樣品、大豆混合樣品、玉米混合樣品、革蘭氏陽性細(xì)菌混合樣品、革蘭氏陰性細(xì)菌混合樣品），以去離子水作為陰性對照模板，按1.2.3反應(yīng)程序及條件進行實時熒光PCR擴增。

1.2.5內(nèi)參基因通用性檢測

為了確定16SrDNA內(nèi)參基因通用性，用內(nèi)參基因引物擴增9種動物源性樣品（牛、羊、豬、雞、鴨、馬、驢、鼠、狗）及其他一些非動物源性樣品（水稻混合樣品、大豆混合樣品、玉米混合樣品、革蘭氏陽性細(xì)菌混合樣品、革蘭氏陰性細(xì)菌混合樣品），以去離子水作為陰性對照模版，按1.2.3反應(yīng)程序及條件進行實時熒光PCR擴增。

1.2.6標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將羊源性成分（100%）標(biāo)準(zhǔn)品提取DNA梯度稀釋，配制成100%、50%、10%、5%、1%的5個梯度標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，每個反應(yīng)設(shè)置3個平行。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液PCR反應(yīng)的Ct值及初始模板濃度的對數(shù)分別繪制16SrDNA內(nèi)參基因和羊種屬特異性基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7模擬混合樣品檢測及回收率分析

取生鮮牛肉、羊肉、豬肉、雞肉、鴨肉按照質(zhì)量比模擬混合肉樣進行不同比例的制備，制備比例分別為羊源性成分占0%、20%、40%、60%、80%、100%。通過內(nèi)參基因?qū)ΨN屬特異性基因表達量的校正，獲得模擬混合樣品的百分含量，并進行檢測樣品回收率分析，以驗證所建立方法的準(zhǔn)確性。按照公式1計算出待測樣品中羊源性成分含量。

X/%=（Qm1/Qt1）×（Qt1/Qt2）×100（1）

式中：X為試樣中羊源成分含量；Qm1為試樣羊特異性引物體系RT-PCR含量平均值（Qutantity Mean）；Qt1為試樣通用引物體系RT-PCR含量平均值；Qt2為含量100%羊標(biāo)準(zhǔn)品通用引物體系RT-PCR含量平均值。

1.2.8市售樣品檢測

采用本研究所建立的鮮肉及鮮肉制品中羊源性成分定量檢測方法對市售不同鮮肉及鮮肉制品進行羊源性成分定量檢測，統(tǒng)計檢測結(jié)果與市售樣品標(biāo)簽標(biāo)注羊源性成分含量的符合情況。

2　結(jié)果與分析

2.1引物和探針的特異性試驗

用羊種屬特異性基因引物擴增9種動物源性樣品（牛、羊、豬、雞、鴨、馬、驢、鼠、狗）及其他一些非動物源性樣品（水稻混合樣品、大豆混合樣品、玉米混合樣品、革蘭氏陽性細(xì)菌混合樣品、革蘭氏陰性細(xì)菌混合樣品）。擴增結(jié)果表明，羊種屬特異性基因引物只有以羊源性樣品的DNA為模板才有熒光信號，其他樣品均沒有熒光信號，表明PCR擴增體系具有良好的擴增特異性（圖1）。

2.2內(nèi)參基因通用性檢測試驗

用內(nèi)參基因引物擴增9種動物源性樣品（牛、羊、豬、雞、鴨、馬、驢、鼠、狗）及其他一些非動物源性樣品（水稻混合樣品、大豆混合樣品、玉米混合樣品、革蘭氏陽性細(xì)菌混合樣品、革蘭氏陰性細(xì)菌混合樣品）。擴增結(jié)果表明，只有以動物源性樣品的DNA為模板才有熒光信號，其他樣品均沒有熒光信號，表明PCR擴增體系對于動物源性成分具有良好的種內(nèi)通用性和種間特異性（圖2）。

圖1　方法特異性檢測熒光擴增曲線Fig.1　Fluorescent amplification curve of specific research method

圖2　內(nèi)參基因通用性檢測熒光擴增曲線Fig.2　Fluorescent amplification curve of reference gene universal research method

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將羊源性成分（100%）標(biāo)準(zhǔn)品提取DNA梯度稀釋，配制成100%、50%、10%、5%、1%的5個梯度標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，分別用羊種屬特異性基因和16SrDNA通用基因的引物和探針對梯度質(zhì)量濃度的羊源性成分DNA標(biāo)準(zhǔn)品進行實時熒光PCR擴增，驗證方法的線性關(guān)系（圖3）。

圖3定量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3　Quantitative standard curve

從圖3表明，羊種屬特異性體系和16SrDNA通用體系都呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，線性擬合度的平方值R2分別達到0.996到0.998，擴增效率（Eff%）分別為106.223%和109.487%。

2.4模擬混合樣品檢測及回收率分析

根據(jù)市售羊肉摻假狀況，按照表2中的方案，模擬制作含有羊/雞、羊/鴨、羊/豬不同成分的混合肉樣，混合肉樣的DNA提取方法參照1.2.2。應(yīng)用所建立的方法體系，通過內(nèi)參基因?qū)ΨN屬特異性基因的校正，測定混合肉樣中羊源性成分百分含量，并進行模擬樣品回收率分析（即測定值與真實值之間的差異），以驗證所建立方法的準(zhǔn)確性。

表2　混合肉樣中各肉種成分的比例Table 2　Percentages of different species in meat mixtures for accuracy evaluation

3組混合肉樣的實時熒光PCR擴增曲線以羊/雞混合（0%、20%、40%、60%、80%、100%）為例，如圖4所示，3組混合肉樣的測定結(jié)果如表3所示。

羊/雞、羊/鴨、羊/豬3組不同成分的混合樣品回收率平均值分別為96.62%、95.14%、96.98%，說明該方法的測定結(jié)果與真實值較為接近，具有較高的準(zhǔn)確度，使用該方法體系能夠較為準(zhǔn)確的測定樣品中羊源性成分含量。

圖4 羊/雞混合肉樣中羊源性成分含量測定RT-PCR擴增曲線Fig.4　RT-PCR amplification curves obtained from the determination of the percentage of sheep/chicken ingredients in meat mixtures

表3　混合肉樣中羊源性成分含量測定結(jié)果Table 3　Results of determinati on of the percentage of sheepdelved ingredients in meat mixture

續(xù)表3　混合肉樣中羊源性成分含量測定結(jié)果Continue table 3　Results of determinati on of the percentage ofsheep-delved ingredients in meat mixture

2.5市售樣品檢測結(jié)果

為了驗證本試驗所建立方法的適用性，采用本研究所建立的定量檢測方法對市售不同鮮肉及鮮肉制品進行羊源性成分含量測定，統(tǒng)計檢測結(jié)果與市售樣品標(biāo)簽標(biāo)注動物源性成分含量的符合情況，結(jié)果見表4。市售樣品標(biāo)簽對于樣品含量的標(biāo)注很少，但都會對樣品成分進行詳細(xì)的標(biāo)注，比如精選羊肉、羊羔肉、羊肉豬肉混合肉等，將只標(biāo)注單一羊肉的樣品含量視為100%，混合肉樣視為＜100%進行測定結(jié)果與標(biāo)簽標(biāo)注的對比參照，此方法可以進行市售樣品的含量測定。

表4　本研究建立的實時熒光PCR方法和市售樣品標(biāo)簽標(biāo)注成分含量比對結(jié)果Table 4　Comparison of results detected by real-time PCR and commercial sample the label ingredients

3　討論

本試驗研究所建立的肉類鑒別方法是以線粒體為基礎(chǔ)，線粒體DNA是高等動物唯一的核外遺傳物質(zhì)且遺傳數(shù)量豐富［12］，經(jīng)加工不易完全降解、種內(nèi)遺傳穩(wěn)定、種間高度變異，是目前肉類鑒別研究常用靶基因的首選［13］。然而，也有相關(guān)研究者認(rèn)為線粒體DNA的數(shù)量在不同物種、不同組織之間存在著表達差異［14-15］，因此本方法的建立是基于肌肉組織的鮮肉及鮮肉制品，不涉及參雜動物心臟或肝臟等組織器官成分的樣品。同時本研究所建立的羊源性成分含量鑒定方法通過大量試驗數(shù)據(jù)驗證，以100%純羊肉為其他物種線粒體DNA差異的表達校正系數(shù)，對種屬特異性基因校正內(nèi)參基因的成分含量進行系數(shù)校正。對于不同動物組織及同一組織不同物種之間含有的線粒體和線粒體DNA的數(shù)量的差異，本課題組將基于數(shù)字PCR技術(shù)進行拷貝數(shù)與DNA表達量之間的相互關(guān)系開展下一步更深入的研究，以期對更全面的肉類樣品進行更加精準(zhǔn)的定量分析。

本試驗研究建立的以內(nèi)參基因校正種屬特異性基因的鮮肉及鮮肉制品中羊源性成分含量的實時熒光PCR測定方法具有較高的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，方法回收率平均值可達到96.25%，無論是羊特異性體系還是通用體系都呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系和較寬的線性范圍，同時樣品實測也具有市場適用性，有效解決了無法依據(jù)摻假輕重情節(jié)（即摻假量化數(shù)值）針對性地進行處罰和治理的難題，為相關(guān)監(jiān)管和執(zhí)法部門進一步加強監(jiān)管、減少摻偽欺詐等行為的發(fā)生提供了可靠的技術(shù)支撐。

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Quantitative Detection Method for Ovine-derived Materials in Fresh Meat and Meat Products Using Universal Primer

ZHAO Xin，LIU Na，CHEN Rui，WANG Cheng，ZHU Zhu，WANG Yong，LAN Qing-kuo*
（Institute of Tianjin Agriculture Quality Standard and Testing Technology，Tianjin 300381，China）

Targeting cytochrome b gene of mitochondrial DNA from beef，sheep，pork，chicken，duck，horse，the specific primers and TaqMan probes of sheep were designed.Combined with real-time PCR technology，the 16SrDNA reference gene was introduced，and the quantitative detection method of sheep in Fresh meat and meat products was established using reference gene correction by exogenous species-specific gene.The established method was validated through specific，universal detection，and analog mixed samples.The results showed a good specificity and a good universality.Through the construction of standard curve，both sheep-specific and universal systems showed a good linear relationship（R2＞0.996）.By Quantity value and the correction coefficient of sheep species-specific gene and 16SrDNA reference gene，the mass percentage content of the sample contained in sheep-derived ingredients could be calculated.The PCR method showed a high accuracy and the average recovery of sheep-derived ingredients in meat mixtures of simulation samples was 96.25%.

16SrDNA reference gene；exogenous species-specific gene；sheep-derived ingredient；quantitative analysis

2016-04-26

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃（14JCQNJC14800）作者簡介：趙新（1983—），女（漢），助理研究員，碩士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品分子檢測技術(shù)研究。

蘭青闊（1987—），男，副研究員，碩士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品安全質(zhì)量分子檢測技術(shù)研究。