鄭麗雪，郭晨，謝建松，唐亞進，王立梅，齊斌，*（.常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇常熟25500；2.蘇州市食品生物技術重點實驗室，江蘇常熟25500）

pH對費氏丙酸桿菌細菌素抑菌性的影響

鄭麗雪1，2，郭晨1，謝建松1，唐亞進1，王立梅1，2，齊斌1，*
（1.常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇常熟215500；2.蘇州市食品生物技術重點實驗室，江蘇常熟215500）

以實驗室保存的一株費氏丙酸桿菌CS1420（Propionibacterium freudenreichii CS1420）為試驗菌株。首先考察了不同初始pH下對其發(fā)酵產細菌素的影響。結果表明：以大腸桿菌ATCC25922為指示菌，當培養(yǎng)基初始pH為6.0時，細菌素抑菌效果最好；以Saccharomyces cerevisiae 2-10515為指示菌，當培養(yǎng)基初始pH為5.5時，細菌素抑菌效果最好。然后用丙酸調節(jié)細菌素粗提物的pH進行抑菌試驗，結果表明，pH對粗提得到的細菌素抑菌性影響很大，當用丙酸將細菌素溶液的pH調至5.5時，細菌素的抑菌活性有顯著提高。

費氏丙酸桿菌；pH；細菌素；抑菌性

丙酸桿菌屬廣泛存在于自然界中［1-2］，被分為兩大類，一類是痤瘡型丙酸桿菌［3］，另一類是乳品丙酸桿菌。乳品丙酸桿菌主要包括費氏丙酸桿菌（P.freudenreichii）、詹氏丙酸桿菌（P.jensenii）、特氏丙酸桿菌（P. thoenii）等，是從乳制品、青貯飼料中分離出來的無致病性的一類丙酸桿菌，現(xiàn)在食品工業(yè)中主要用于生產丙酸、維生素B12、葉酸、乳品發(fā)酵劑、發(fā)酵蔬菜、露蘆糖等［4-6］。另外，乳品丙酸桿菌在代謝過程中會合成特殊的肽或蛋白質，這類代謝物（細菌素）是丙酸桿菌產生的異型抑菌物質，有很好的特性［7-9］，比如：其具有廣泛的抑菌作用，且抑菌效果優(yōu)于苯甲酸鈉、山梨酸鉀等常見的化學防腐劑，所以，丙酸桿菌細菌素在食品防腐保鮮中具有很好的應用前景，受到了研究人員的廣泛關注。

如何去提高丙酸桿菌細菌素的抑菌活性是當前研究的熱點問題，已有研究表明，pH對費氏丙酸桿菌細菌素抑菌性的影響很大。馮晗等［10］，榮紹豐等［11］分別研究了丙酸桿菌代謝物對惡臭假單胞菌、酵母菌的抑制活性，研究發(fā)現(xiàn)，pH越低，丙酸桿菌代謝物抑菌活性越高。馬悅培等人［12］研究了不同初始pH對丙酸桿菌細菌素發(fā)酵的影響，結果顯示，pH對丙酸桿菌細菌素發(fā)酵也有很大影響。基于此，本研究以實驗室保存的一株費氏丙酸桿菌CS1420為實驗菌株，一方面考察不同初始pH對其發(fā)酵產細菌素的影響，另一方面，本研究將發(fā)酵產物中的細菌素進行粗提處理，進一步考察pH對粗提得到的細菌素抑菌活性的影響，這方面的研究內容目前鮮有人涉及。此研究旨在為后續(xù)的擴大試驗奠定理論基礎。

1　材料與方法

1.1菌種

費氏丙酸桿菌（Propionibacterium freudenreichii CS1420，簡稱為P.freudenreichii CS1420）、大腸桿菌（ATCC25922）、酵母菌（Saccharomycescerevisiae2-10515，以下簡稱為S.cerevisiae 2-10515）：均為常熟理工學院生物與食品工程學院發(fā)酵工程中心保存。

1.2儀器

LDZX-50KB型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；FA604A型精密電子天平：上海精天電子儀器有限公司；LHR-250型霉菌培養(yǎng)箱：上海索譜儀器有限公司；CR22GⅡ型高速冷凍離心機：日本日立公司；SW-CJ-1B超凈工作臺：蘇凈集團安泰公司；Bio-Rad xMark酶標儀、Bio-Rad 1575洗板機：美國Bio-Rad公司；Milli-Q Advantage超純水儀：美國Millipore公司。

1.3培養(yǎng)基

丙酸桿菌培養(yǎng)基：改良PYG培養(yǎng)基［13］；大腸桿菌培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g；蒸餾水1000 mL，pH 7.0；酵母菌培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基［14］。

1.4菌種活化

將保存的P.freudenreichii CS1420菌株劃線接種到改良的PYG固體培養(yǎng)基上，30℃厭氧培養(yǎng)2.5 d，連續(xù)活化兩代。

挑取平板上活化好的大腸桿菌ATCC25922接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h；挑取平板上活化好的S.cerevisiae 2-10515單菌落接種于PDA液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24 h。

1.5不同初始pH發(fā)酵的P.freudenreichii CS1420細菌素對大腸桿菌的抑制作用

將活化好的P.freudenreichii CS1420的種子液，分別接種到不同初始pH（5.5、6.0、6.5、7.0）的改良PYG培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)10 d，每天取樣，離心取上清液留樣備用。取若干只試管，每只試管中加入1 mL活化好的大腸桿菌菌液和0.5 mL P.freudenreichii CS1420發(fā)酵上清液，以加1 mL的無菌的大腸桿菌培養(yǎng)基和0.5 mL無菌的PYG培養(yǎng)基作為空白對照，37℃條件下培養(yǎng)12 h，分別取200 μL于酶標板上，在酶標儀上讀數(shù)測定OD620?？疾觳煌跏紁H條件下，不同發(fā)酵時間細菌素對大腸桿菌ATCC25922的抑制作用。每組試驗做3個平行。

1.6不同初始pH發(fā)酵的P.freudenreichii CS1420細菌素對酵母菌的抑制作用

另取若干只試管，每只試管中加入1 mL活化好的酵母菌菌液和1.5中處理好的0.5 mL P.freudenreichii CS1420發(fā)酵上清液，以加1 mL的無菌的酵母菌培養(yǎng)基和0.5 mL無菌的PYG培養(yǎng)基作為空白對照，37℃條件下培養(yǎng)24 h，分別取200 μL于酶標板上，在酶標儀上讀數(shù)測定OD560?？疾觳煌跏紁H條件下，不同發(fā)酵時間細菌素對Saccharomyces cerevisiae 2-10515的抑制作用。每組試驗做3個平行。

1.7不同pH對粗提得到的細菌素抑菌性的影響

將P.freudenreichiiCS1420發(fā)酵液在4℃、8000r/min條件下離心10 min，在上清液中邊攪拌邊緩慢加入（NH4）2SO4粉末，使得（NH4）2SO4終濃度為70%，攪拌均勻后放置于4℃冰箱中沉淀過夜，然后于4℃、12 000 r/min條件下離心10 min，棄上清，將沉淀加水溶解后，用分子量為1 000 Da的透析袋透析48 h，然后將透析液進行冷凍干燥處理，冷凍干燥后加一定量的水溶解冷凍干燥后的沉淀物，并將其分成4份，分別用丙酸調節(jié)pH為5.1、5.3、5.5、5.7，分別取200 μL參照文獻［15］中改動后的牛津杯-雙層平板法進行抑菌試驗，指示菌選用大腸桿菌ATCC25922。以此考察不同pH對純化得到的細菌素抑菌性的影響。

2　結果與討論

2.1不同初始pH發(fā)酵的P.freudenreichii CS1420細菌素對大腸桿菌抑制作用

不同初始pH發(fā)酵時細菌素對大腸桿菌抑制作用見圖1。

不同初始pH發(fā)酵時，P.freudenreichii CS1420細菌素對大腸桿菌抑制作用如圖1所示，其中0 d為空白對照組，由圖可知，P.freudenreichii CS1420經不同初始pH發(fā)酵后，不同時間的發(fā)酵液均有抑制大腸桿菌ATCC25922的作用，但是發(fā)酵前幾天抑菌作用不明顯，隨著發(fā)酵時間的延長，抑菌作用增強，發(fā)酵第8天～9天的代謝產物抑制作用最強，這和榮紹豐等人、馮晗等人的研究一致，即發(fā)酵后期（第8天左右）丙酸桿菌代謝物抑菌活性最高。另外，從圖中可以明顯看出，不同初始pH對P.freudenreichii CS1420細菌素抑菌性有很大影響，當初始pH為6.0時，P.freudenreichiiCS1420細菌素對大腸桿菌ATCC25922抑制作用最強。

圖1 不同初始pH發(fā)酵時細菌素對大腸桿菌抑制作用Fig.1　Inhibitory effects of bacteriocins at different initial pH fermentation on E.coli

2.2不同初始pH發(fā)酵的P.freudenreichii CS1420細菌素對酵母菌抑制作用

不同初始pH發(fā)酵時細菌素對酵母菌抑制作用見圖2。

圖2 不同初始pH發(fā)酵時細菌素對酵母菌抑制作用Fig.2　Inhibitory effects of bacteriocins at different initial pH fermentation on yeast

不同初始pH發(fā)酵時，P.freudenreichii CS1420細菌素對酵母菌抑制作用如圖2所示，由圖可知，P. freudenreichii CS1420經不同初始pH發(fā)酵后，不同時間的發(fā)酵液對Saccharomyces cerevisiae 2-10515也都有抑制作用，同樣是發(fā)酵前幾天抑菌作用不明顯，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液抑菌作用增強，發(fā)酵第8天～9天的代謝產物抑制作用最強。另外，當初始pH為5.5時，P.freudenreichii CS1420細菌素對Saccharomyces cerevisiae 2-10515抑制作用最強。

2.3不同pH對粗提得到細菌素抑菌性的影響

根據(jù)2.1、2.2的試驗結果，選取第 9天的 P. freudenreichii CS1420發(fā)酵液按照1.7方法進行鹽析、透析、冷凍干燥等處理后，用丙酸調節(jié)其pH分別為5.1、5.3、5.5、5.7，進一步研究不同pH對粗提得到的細菌素抑菌性的影響，試驗結果如圖3所示。

圖3　不同pH對細菌素抑菌性的影響Fig．3　Inhibitory effects of bacteriocins at different initial pH fermentation

由圖3可知，pH對粗提得到的細菌素抑菌性影響很大，牛津杯A中細菌素溶液形成的抑菌圈直徑為12.8 mm，B為17.2 mm，C為23.3 mm，D為17.1 mm。結果表明，用丙酸將細菌素溶液的pH調節(jié)為5.5時，抑菌物質的抑菌活性有顯著提高。所以，盡管丙酸桿菌細菌素具有廣泛的pH耐受范圍［16-17］，但在不同pH條件下，細菌素抑菌活性差別很大。

3　結論與展望

1）以大腸桿菌ATCC25922為指示菌，當培養(yǎng)基初始pH為6.0時，P.freudenreichii CS1420產細菌素抑菌作用最好；以Saccharomyces cerevisiae 2-10515為指示菌，當培養(yǎng)基初始pH為5.5時，細菌素抑菌作用最好。

2）用丙酸調節(jié)粗提處理后的細菌素溶液的pH，然后進行抑菌試驗，結果發(fā)現(xiàn)，pH對粗提得到的細菌素抑菌性影響很大，當用丙酸將細菌素溶液的pH調至5.5時，抑菌物質的抑菌活性有顯著提高。

發(fā)酵條件的優(yōu)化與否直接影響到代謝方式及代謝流量的變化，從而影響目的產物的產量。國內外有學者針對細菌素產量做過發(fā)酵條件優(yōu)化研究［18-20］，但是相關報道較少。所以，本研究待開展的工作是進一步對P.freudenreichii CS1420進行發(fā)酵條件的優(yōu)化研究，得到發(fā)酵生產細菌素的最佳條件，然后結合本研究的結果，最終獲取P.freudenreichii CS1420細菌素產生最大抑菌活性的條件，以期為工業(yè)化生產奠定理論參考。

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Effect of pH on Antimicrobial Activity of Propionibacterium freudenreichii Bacteriocins

ZHENG Li-xue1，2，GUO Chen1，XIE Jian-song1，TANG Ya-jin1，WANG Li-mei1，2，QI Bin1，*
（1.College of Biology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，Jiangsu，China；2.Suzhou Key Laboratory of Food and Biotechnology，Changshu 215500，Jiangsu，China）

Propionibacterium freudenreichii CS1420 was as experimental strains.Firstly，the effects of different pH on fermentation of Propionibacterium freudenreichii Bacteriocins were investigated.The result showed：the antimicrobial activity were best by using Eoli ATCC25922 as indicator strains when the medium initial pH was 6.0，the antimicrobial activity were best by using Saccharomyces cerevisiae 2-10515 as indicator strains when the medium initial pH was 5.5.Then，bacteriocins crude extract pH were adjusted and then bacteriostatic experiments were carried out.The result showed：the effect of pH on crude extract bacteriocins was tremendous.The antimicrobial activity of bacteriocins improved significantly when crude extract bacteriocins solution pH were adjusted 5.5 with propionic acid.

Propionibacterium freudenreichii；pH；bacteriocins；antimicrobial activity

2015-09-10

江蘇省科技支撐計劃項目（BE2013339）；蘇州市科技計劃項目（SYN201226）；蘇州市科技計劃項目（SYN201417）；常熟理工學院大學生實踐創(chuàng)新訓練計劃項目

鄭麗雪（1982—），女（漢），實驗師，碩士，研究方向：食品生物技術。