楊文斌，羅惠波，葉光斌，邊名鴻，萬世旅，鐘姝霞（四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000）

溪黃草中黃酮類物質的提取工藝優(yōu)化

楊文斌，羅惠波，葉光斌，邊名鴻*，萬世旅，鐘姝霞
（四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000）

研究利用超聲波輔助提取溪黃草中黃酮類化合物的工藝條件。以黃酮類物質提取率為指標，通過單因素試驗、正交試驗確定了溪黃草中黃酮類物質的最佳提取工藝條件。結果表明：溪黃草黃酮類物質的最佳提取工藝條件為：超聲功率為225 W，乙醇濃度為65%，提取溫度為50℃，料液比為1∶46（g/mL），超聲提取時間25 min。在最優(yōu)條件下，黃酮類化合物的提取得率可達6.84%，提取的效果最佳，且資源消耗低。

溪黃草；黃酮類物質；提取工藝；超聲提取

溪黃草為唇形科植物線紋香茶菜的干燥全草，又名山熊膽、風血草、黃汁草和手擦黃等，具有清熱利濕、退黃、涼血散瘀之功，用于濕熱黃疸、濕熱瀉痢、跌打瘀腫。然而，目前對于溪黃草的開發(fā)利用不足，僅限于溪黃草袋泡茶、溪黃草沖劑及用于加工成復方中成藥等。而黃酮類化合物被認為是溪黃草中主要有效成分之一，具有清除自由基、抗氧化、抗突變、抗炎、抗菌、舒張血管等功能［1-5］，因此對于溪黃草中黃酮類物質的提取、開發(fā)、利用具有較大的實際意義和經濟價值［6］。

黃酮類物質常用的提取方法有微波輔助提取法、有機溶劑提取法、水浸法、酶輔助提取法等。其中超聲波輔助提取法相對其他方法而言具有許多優(yōu)點：操作較為簡單；成本低；提取效率較高；適用于提取熱敏性物質；萃取快速且比較完全；適用范圍很廣等［7］。本文主要采用單因素試驗和正交試驗對溪黃草中黃酮類化合物的提取工藝進行優(yōu)化，旨在為溪黃草中藥材的開發(fā)與利用提供一定的理論參考和技術支持。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

溪黃草：市售，將溪黃草置于60℃烘箱內干燥至恒重后粉碎，粒度在50目～300目，置于封口袋中備用。

蘆丁標準品：中國食品藥品檢定研究所；乙醇、乙酸、乳酸乙酯、乙酸乙酯、丙酮、丙三醇、乳酸、NaNO2、Al（NO3）3、NaOH：均為分析純，成都科龍化工試劑廠。

1.2儀器與設備

T6新世紀紫外/可見分光光度：北京普析通用儀器有限公司；AR2140電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ5200DB數控超聲清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；DHG-9245A電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；TDL-50大容量平衡離心機：金壇市旺實驗儀器廠。

1.3方法

1.3.1總黃酮標準曲線的繪制

準確稱取干燥至恒重的蘆丁10 mg，用60%微熱乙醇于燒杯中溶解，后移至100 mL容量瓶定容，得濃度為0.1 mg/mL的標準液。準確吸取標準液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于6只具塞試管中，加30%乙醇至6 mL，加5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min。加10%Al（NO3）3溶液0.3mL，搖勻，放置6 min。加1mol/L NaOH溶液4 mL，搖勻，放置10 min～15 min，于510 nm波長處測定吸光度，并繪制出標準曲線［8］。

1.3.2總黃酮提取工藝優(yōu)化試驗

1.3.2.1提取方法的確定

索式提取法：準確稱取2.00g溪黃草粉末于索氏提取器中，加入200mL的70%乙醇溶液，95℃水浴約12 h，至提取器中液體為無色，取出提取液定容至200 mL，測其吸光度，求得提取得率［9］。

水浸提取方法：準確取1.50 g溪黃草粉末，加入150 mL水，60℃水浴，離心，過濾至無明顯懸浮顆粒為止，定容并測其吸光度。

超聲波輔助提取方法：準確取1.50 g溪黃草粉末，加入150 mL 70%的乙醇，60℃超聲波處理30 min，離心，定容并測其吸光度。

乙醇浸泡提取方法：準確取1.50 g溪黃草粉末，加入150 mL 70%的乙醇，于60℃水浴2 h，離心，定容并測其吸光度。

1.3.2.2單因素試驗

以1.00 g溪黃草粉末為提取對象，固定乙醇濃度70%，料液比1∶30（g/mL），提取溫度50℃，超聲功率225 W，超聲處理25 min，離心，測其吸光度。在此工藝條件基礎上，變動其中1個因素，分別探討其對黃酮得率的影響。

1）超聲波功率設計：150、175、200、225、250 W 5個水平；

2）溶劑類型設計：乙醇、乙酸、乳酸乙酯、乙酸乙酯、丙酮、丙三醇和乳酸7個因素；

3）超聲時間設計：15、20、25、30、35 min 5個水平；

4）乙醇濃度設計：40%、50%、60%、70%、80%、90%（體積比）6個水平；

5）料液比設計：1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70（g/mL）7個水平；

6）提取溫度設計：40、50、60、70℃4個水平。

1.3.3總黃酮提取的正交試驗

根據上述單因素試驗確定的范圍，對乙醇濃度、料液比、水浴溫度和超聲波處理時間度為考察的因素，其中單因素選取范圍見表1。以得率為指標，采用標準正交表L16（44）設計正交試驗，其中設置1組空白，分析結果得出溪黃草中黃酮類物質的最佳提取工藝條件。

表1 試驗因素水平設計表Table 1　The level of experimental factors design

1.3.4得率的計算

得率/%=總黃酮的質量/原料的質量×100

2　結果分析

2.1總黃酮標準曲線

蘆丁標準曲線如圖1所示。

圖1蘆丁標準曲線Fig.1　Standard curve of rutin

試驗結果如圖1所示，以蘆丁濃度x對吸光度y進行線性回歸，回歸方程為y=1.296 4x-0.006 4，R2= 0.998 8，蘆丁濃度在0～0.5 mg/mL的范圍內呈良好線性關系。

2.2影響總黃酮提取率的單因素試驗

2.2.1提取方法的確定

不同方法對提取得率的影響如圖2所示。

圖2　不同方法對提取得率的影響Fig.2　The effect of different methods on extraction rate

由圖2可知，在料液比、溶劑濃度等試驗條件相同的情況下，超聲波輔助提取法的得率為6.07%，明顯優(yōu)于索氏提取法（5.17%）、乙醇浸泡提取法（4.85%）和水浴浸泡提取法（2.93%）。因此后續(xù)試驗選擇超聲波輔助提取法。

2.2.2不同超聲功率對黃酮類物質提取得率的影響不同超聲功率對提取得率的影響如圖3所示。

圖3　不同超聲功率對提取得率的影響Fig.3　Effects of different ultrasonic power on extraction rate

由圖3可知，隨著功率的增大，超聲波對細胞壁的破碎作用增強，胞內黃酮類物質溶出速率增加，故其提取率逐漸增大［10］，當超聲功率為225 W時，黃酮類物質提取率達最大值；當功率繼續(xù)增大到一定程度時，會造成局部溫度過高，黃酮類物質易在高溫條件下發(fā)生降解和氧化［11］，使提取率降低。故225 W為最適超聲功率。

2.2.3不同溶劑對黃酮類物質提取得率的影響

圖4 不同溶劑對提取得率的影響Fig.4　The effect of different solvent on extraction rate

不同溶劑對提取得率的影響如圖4所示。由圖4可知，以乙醇作為溶劑的得率均優(yōu)于其他溶劑，其得率為5.04%明顯高于水作為溶劑的提取得率（2.53%），其后則是乙酸（4.09%）、乙酸乙酯（4.15%）和丙酮（4.17%）等提取得率較高。綜合考慮溶劑成本，選擇乙醇作為提取溶劑。

2.2.4不同提取時間對黃酮類物質提取得率的影響不同提取時間對提取得率的影響如圖5所示。

圖5　不同提取時間對提取得率得影響Fig.5　The effect of different time on extraction rate

由圖5可知，在超聲波處理15 min后到25 min之間提取得率不斷增加，在超聲波處理時間為25 min時，達到最高的提取得率6.47%，而在超聲波處理25 min后，得率開始不斷減少。其原因可能是因為時間的增加可以增加浸提的效果，但同時也會加大黃酮類化合物的破壞。因此，最佳的提取時間為25 min。

2.2.5不同乙醇濃度對黃酮類物質提取得率的影響

乙醇濃度對提取得率的影響如圖6所示。

圖6 乙醇濃度對提取得率的影響Fig.6　The effect of different Ethanol concentration on extraction g rate

由圖6可知，在乙醇濃度為40%到70%范圍內，黃酮類化合物的提取得率會隨著乙醇濃度的升高而增加，在70%處達到最大值。乙醇濃度大于70%，黃酮類化合物的提取得率隨著乙醇濃度的增加而降低。其原因可能是乙醇濃度過大，浸提體系中溶出較多醇溶性雜質、色素、親脂性強的物質與黃酮類化合物競爭同乙醇-水分子復合體系結合，導致體系的通透性下降，使黃酮類化合物提取率下降。因此選擇70%乙醇濃度為最佳乙醇濃度。

2.2.6不同料液比對黃酮類物質提取得率的影響

料液比對提取得率的影響如圖7所示。

圖7　料液比對提取得率的影響Fig.7　The effect of different ratio of liquid on material to extraction rate

由圖7可知，料液比為1∶10（g/mL）和1∶20（g/mL）時，提取得率基本不變，約4.4%，而后在逐步提高料液比時提取得率也會增加，直到當料液比為1∶50（g/ mL）時，其得率達到為6.81%；隨后即使增大料液比，提取得率變化不大，且用量過大會增加后續(xù)工藝的難度，能耗較高，也會加大黃酮類物質的損失［12］，所以最適料液比為1∶50（g/mL）。

2.2.7不同提取溫度對黃酮類物質提取得率的影響

溫度對提取得率的影響如圖8所示。

圖8 溫度對提取得率的影響Fig.8　The effect of different temperature on extraction rate

由圖8可知，隨著溫度升高，黃酮類物質提取得率在50℃時達到了最大值6.48%，溫度繼續(xù)升高，得率下降。其原因是由于升高溫度有利于提取液中粘度的降低，從而可以提高黃酮類物質的提取率，但是當溫度升高到一定程度，黃酮類物質的結構發(fā)生變化，導致提取率有所降低，綜合考慮，最佳提取溫度為50℃。

2.3正交試驗結果分析

正交試驗結果如表2所示，方差分析如表3所示。

表2 正交試驗結果表Table 2　The orthogonal experiment results table

表3 方差分析表Table 3 The variance analysis table

由方差分析可知，C因素F值FC＞F0.05為顯著影響的因素，顯著性水平取0.05；F0.05＞FA＞FD＞FB，故A、D和B 3個因素均達不到顯著水平，即，乙醇濃度、提取時間和料液比均為不顯著因素。A、B、C和D 4個因素的極差大小排序為C＞A＞B＞D，4個因素影響次序為：浸提溫度＞乙醇濃度＞料液比＞浸提時間。再各個因素均值大小，可得到每個因素的最佳水平。因此，該試驗的最佳提取工藝為C2A1B4D2，即水浴溫度為50℃，溶劑為65%乙醇，料液比1∶46（g/mL），超聲波處理時間為25 min。

最優(yōu)提取工藝條件的驗證性試驗結果見表4。

表4　驗證試驗結果Table 4　The results of verification tests

3　結論

由表4可知，正交優(yōu)化試驗后最佳提取工藝下的試驗結果優(yōu)于各單因素試驗結果，所以試驗的結果能夠顯示出正交優(yōu)化試驗具有良好的試驗結果，具有可操作性，而且試驗結果的相對標準差為0.369，可見試驗結果的穩(wěn)定性很好，因此，該試驗的最佳提取工藝為C2A1B4D2，即水浴溫度為50℃，溶劑為65%乙醇，料液比1∶46（g/mL），超聲波處理時間為25 min。

本文通過單因素試驗、正交試驗得出溪黃草黃酮類物質的最佳提取工藝條件為：超聲功率225 W，提取溫度50℃，溶劑為65%乙醇，料液比1∶46（g/mL），超聲波處理25 min，在此條件下黃酮類物質的提取率可達6.84%，黃酮類物質的提取率高，資源消耗低，且通過驗證試驗分析可知，該提取工藝條件的可操作性強，穩(wěn)定性好，為溪黃草黃酮類物質的提取提供了理論和技術參考。

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Optimization of the Extraction Process of Flavonoids from the Linearstripe Rabdosia Herb

YANG Wen-bin，LUO Hui-bo，YE Guang-bin，BIAN Ming-hong*，WAN Shi-lü，ZHONG Shu-xia
（College of Bioengineering，Sichuan University of Science&Engineering，Zigong 643000，Sichuan，China）

Process conditions of flavonoids extracting from Linearstripe Rabdosia Herb by ultrasonic wave were studied.The yield of flavonoids was considered as the indicator to optimize the main influencing factors of extraction of Linearstripe Rabdosia Herb by single factor test and orthogonal experiment design.The results suggested that the extraction yield of flavonoids was 6.84%under the condition of 225 W，50℃，25 min，the alcohol concentration and the ratio of the Linearstripe Rabdosia Herb to extraction solvent were respectively 65% and 1∶46（g/mL）.

Linearstripe Rabdosia Herb；flavonoids；extraction process；ultrasonic extraction

2015-09-12

楊文斌（1989—），男（漢），碩士研究生，主要從事發(fā)酵工程方向的研究。

邊名鴻（1979—），女，副教授，主要從事發(fā)酵工程相關的教學與科研工作。