馮濤，劉鵬，劉海燕，鎖然（.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，河北保定07000；.河北大學(xué)工商學(xué)院實(shí)驗(yàn)管理中心，河北保定07000；.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定07000）

白藜蘆醇分子印跡聚合物的應(yīng)用及性能研究

馮濤1，劉鵬2，劉海燕1，鎖然3
（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，河北保定071000；2.河北大學(xué)工商學(xué)院實(shí)驗(yàn)管理中心，河北保定071000；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000）

采用分子印跡技術(shù)以白黎蘆醇為模板分子，選擇丙烯酰胺作為白藜蘆醇印跡聚合物的功能單體，氯仿和四氫呋喃的混合溶液作為印跡聚合物合成溶劑，制備了白黎蘆醇分子印跡聚合物，考察了分子印跡聚合物的吸附性能、選擇性能以及固相萃取性能。優(yōu)化分子印跡固相萃取的萃取條件，選擇30%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇-水溶液5 mL作為上樣溶液，選擇40%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇-水溶液作為淋洗液、80%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇-水溶液作為洗脫液。

虎杖；白藜蘆醇；高效液相色譜；提取純化；分子印跡

白藜蘆醇具有多種生物活性，主要包括抗腫瘤、心血管保護(hù)、防治骨質(zhì)疏松、抗氧化和清除自由基等［1-2］。白藜蘆醇在常見(jiàn)的藥用植物中廣泛存在，如虎杖、決明、藜蘆等。但是由于其在天然植物中的含量較低，分離純化得到高含量成品的成本較高，大大限制了其在醫(yī)藥、保健食品等領(lǐng)域中的推廣應(yīng)用。國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)和銷(xiāo)售白藜蘆醇的企業(yè)，均以天然植物（葡萄或中藥虎杖）為原料來(lái)提取分離白藜蘆醇。目前，白藜蘆醇的分離純化主要采用有機(jī)溶劑提取、硅膠柱層析或大孔吸附樹(shù)脂吸附等方法。但是，這些分離純化方法有機(jī)溶劑消耗量大，環(huán)境污染嚴(yán)重，操作相對(duì)繁瑣，產(chǎn)率低，產(chǎn)物雜質(zhì)較多；高速逆流色譜、超臨界流體色譜技術(shù)在分離純化白藜蘆醇方面得到了較好效果，產(chǎn)品純度高，但其生產(chǎn)設(shè)備昂貴，提取成本相對(duì)較高［3-7］。因此，探索新的分離純化技術(shù)，提高分離純化效率尤為重要。本文擬采用分子識(shí)別性能好的分子印跡聚合物進(jìn)一步純化白藜蘆醇粗提物，達(dá)到簡(jiǎn)化提取物純化過(guò)程、提高白藜蘆醇分離純化效率的目的。

1　材料與方法

1.1主要試驗(yàn)儀器

Agilent1100高效液相色譜儀（配DAD檢測(cè)器）：美國(guó)Agilent；色譜柱，Diamonsil C18柱（250 mm× 4.6 mm×5 μm）：北京華瑞博遠(yuǎn)科技有限公司；FD5-2.5真空冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DF-101S 78-1磁力恒溫加熱攪拌器：國(guó)華電器有限公司；BS 224 S電子分析天平：美國(guó)sartorius公司；KUDOS SK5200H超聲波清洗器：天津市瑞普電子儀器公司。

1.2主要試驗(yàn)試劑及材料

虎杖：河北安國(guó)藥材市場(chǎng)；白藜蘆醇（Res）純品（≥98%）：天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開(kāi)發(fā)有限公司；丙烯酰胺（AM），分析純：天津醫(yī)藥公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）：德國(guó)FLUKA公司；偶氮二異丁腈（AIBN），分析純：天津市福晨化學(xué)試劑廠；95%乙醇，分析純：天津市化學(xué)試劑廠；乙腈，色譜純：上海市化學(xué)試劑廠；純凈水：樂(lè)百氏。

1.3方法

1.3.1白藜蘆醇的高效液相色譜檢測(cè)方法

色譜柱：Diamonsil C18柱（4.6 mm i.d.×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（40-60，體積比）；流動(dòng)相流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：306 nm。

1.3.2白藜蘆醇分子印跡聚合物的制備方法［8-13］

聚合物的合成采用溶液聚合方法，以反式白藜蘆醇為模板分子、丙烯酰胺（AM）為功能單體、偶氮二異丁腈（AIBN）為引發(fā)劑進(jìn)行自由基引發(fā)聚合。

稱取0.45 g（2 mmol）白藜蘆醇和0.71 g（10 mmol）功能單體丙烯酰胺充分溶解于（10 mL氯仿+5 mL四氫呋喃）混合溶液中，置于封閉管中超聲10 min后，放置3 h，使模板分子與功能單體充分發(fā)生作用，再加入8 g（40 mmoL）交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）和100 mg引發(fā)劑偶氮二異丁腈，充分混溶后，通氮?dú)饷撗?0 min，在真空狀態(tài)下密封，然后于50℃恒溫水浴中聚合24 h，所得的棒狀聚合物用研缽磨碎并過(guò)200目孔篩，取粒徑小于75 μm的顆粒，用5%（體積分?jǐn)?shù)）乙酸的甲醇溶液置索氏提取器中提取24 h，除去模板分子及未反應(yīng)化合物，然后用乙腈洗滌除去殘留的乙酸和甲醇，聚合物顆粒經(jīng)丙酮反復(fù)沉降，除去細(xì)顆粒后真空干燥，即為白藜蘆醇分子印跡聚合物（MIP）?？瞻拙酆衔锏闹苽浞椒ㄍ希醇幽０宸肿?，得到非印跡聚合物（NMIP）。

2　結(jié)果與討論

2.1白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取白藜蘆醇對(duì)照品0.0250 g置于25 mL容量瓶中，用40%甲醇溶解定容，配成1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液備用，低溫、避光保存。分別準(zhǔn)確取儲(chǔ)備液0.025、0.25、 0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL，用40%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇定容至25 mL，搖勻。分別相當(dāng)于質(zhì)量濃度為1.0、10.0、20.0、40.0、80.0、120.0、160.0、200.0、240.0、280.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。用0.45 μm濾膜過(guò)濾，分別取10 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積。以色譜峰面積A為縱坐標(biāo)、白藜蘆醇質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1。

圖1 白藜蘆醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of resveratrol

由圖1可以看出，白藜蘆醇在質(zhì)量濃度1.0 μg/mL～280.0 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程A=52.33C＋106.21，線性相關(guān)系數(shù)r=0.999 3。

2.2白藜蘆醇分子印跡聚合物的制備

2.2.1白藜蘆醇分子印跡聚合物功能單體及溶劑的選擇

白藜蘆醇含有多個(gè)酚羥基，具有一定的極性，不溶于氯仿等非極性溶劑，一般認(rèn)為在非共價(jià)分子印跡技術(shù)中，溶于極性溶劑的化合物不適宜作為模板分子。因此，合成白藜蘆醇印跡聚合物的功能單體必須能在極性溶劑中與白藜蘆醇形成氫鍵。甲基丙烯酸是分子印跡聚合物常用的功能單體。由于在極性溶劑中酰胺比羧酸能形成更強(qiáng)的氫鍵，因此，選擇丙烯酰胺作為白藜蘆醇印跡聚合物的功能單體，氯仿和四氫呋喃的混合溶液作為印跡聚合物合成溶劑。

2.2.2白藜蘆醇在分子印跡聚合物上的結(jié)合等溫線及結(jié)合特性

采用靜態(tài)平衡法測(cè)定印跡聚合物對(duì)不同濃度白藜蘆醇（Res）的結(jié)合等溫線。精確稱取10份相同的白藜蘆醇印跡聚合物粉末，分別置于10個(gè)10 mL離心管中，分別加入5 mL不同濃度（0.2 mmol/L～4.0 mmol/L）的白藜蘆醇-乙醇溶液，在25℃下恒溫振蕩8 h后，在1 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心，取上清液用高效液相色譜法在306 nm波長(zhǎng)處測(cè)定平衡溶液中的白藜蘆醇的含量，即吸附平衡濃度（Ce）。模板分子在印跡聚合物上的平衡吸附量（Q，mmol/g）可通過(guò)下式計(jì)算：

式中：C0和Ce分別為模板分子的起始濃度和平衡濃度，mmol/L；V為溶液的體積，mL；W為印跡聚合物的質(zhì)量，g。

同時(shí)，按上述方法做空白聚合物（NMIP）的靜態(tài)吸附試驗(yàn)。

通過(guò)靜態(tài)吸附試驗(yàn)，研究了白藜蘆醇在印跡聚合物和非印跡聚合物上的吸附行為。MIP和NMIP對(duì)白藜蘆醇的結(jié)合等溫線見(jiàn)圖2。

圖2MIP和NMIP對(duì)白藜蘆醇的結(jié)合等溫線Fig.2　Binding isotherms of resveratrol on MIP and NMIP

由圖2可以看出，印跡聚合物對(duì)白藜蘆醇具有一定的吸附能力，而非印跡聚合物對(duì)白藜蘆醇吸附很小，表明印跡聚合物對(duì)白藜蘆醇確實(shí)具有印跡能力。白藜蘆醇可通過(guò)氫鍵和空間匹配達(dá)到吸附，而對(duì)于NMIP，雖然白藜蘆醇也能與聚合物上的酰胺健形成氫鍵，但由于位置關(guān)系，不具有作用位點(diǎn)的匹配性，每個(gè)白藜蘆醇分子往往只能與吸附劑形成一個(gè)氫鍵，這樣作用力遠(yuǎn)小于MIP對(duì)白藜蘆醇的作用力，因此NMIP對(duì)白藜蘆醇吸附力很弱。

式中：Q和Qmax為平衡結(jié)合量，μmol/g和最大表觀結(jié)合量，μmol/g；Ce為溶液中平衡濃度，mol/L；KD為結(jié)合位點(diǎn)的平衡離解常數(shù)，mol/L。當(dāng)以Q/Ce對(duì)Q作圖時(shí)，根據(jù)線性關(guān)系的斜率和截距可求得KD和Qmax兩個(gè)參數(shù)。

白藜蘆醇在MIP上的Scatchard分析見(jiàn)圖3。

圖3　MIP的Scatchard曲線Fig.3　The scatchard curve of MIP

由圖3可以看出，Scatchard曲線呈非線性相關(guān)性，說(shuō)明白藜蘆醇在MIP上的結(jié)合位點(diǎn)的能量不均。將圖中散點(diǎn)分成兩部分，分別進(jìn)行線性回歸，得到條不同斜率的直線，說(shuō)明在所研究的模板分子濃度圍內(nèi)，MIP主要存在著兩種不同能量的結(jié)合位點(diǎn)。根直線的斜率和截距，分別計(jì)算出兩種結(jié)合位點(diǎn)的離常數(shù)KD和最大表觀結(jié)合量Qmax。

對(duì)于高能結(jié)合位點(diǎn)，KD1和 Qmax1分別為 1.58× 0-4mol/L和36.61 μmol/g；對(duì)于低能結(jié)合位點(diǎn)，KD2和max2分別為2.38×10-3mol/L和125.37 μmol/g。MIP中產(chǎn)生有兩種不同結(jié)合能量的位點(diǎn)，這說(shuō)明模板分子白藜蘆醇與功能單體預(yù)組織時(shí)可能存在著兩種組織方式，因而在MIP中就留下兩種結(jié)合位點(diǎn)。

2.2.3白藜蘆醇分子印跡固相萃取柱的制備及分離純化條件優(yōu)化

稱取200 mg白藜蘆醇分子印跡聚合物粉末（過(guò)200目篩），均勻裝填進(jìn)500 mg/3 mL的聚丙烯固相萃取空柱中，柱的上、下端均以聚乙烯微孔篩板固定。固相萃取過(guò)程中每次活化、上樣、淋洗及洗脫溶液的體積均為5 mL。固相萃取柱在每次使用前，依次用5 mL甲醇、5 mL水活化。萃取柱的流速控制在1 mL/min左右，萃取過(guò)程中的溶液由高效液相色譜儀分析。

固相萃取的優(yōu)點(diǎn)之一是萃取柱的負(fù)載量大，但使用不同溶劑時(shí)萃取柱的負(fù)載量也會(huì)隨之變化。因?yàn)榘邹继J醇易溶于乙醇，而且其他有機(jī)溶劑一般有不同程度的毒性，不宜應(yīng)用在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域，故選擇不同體積比的乙醇-水溶液作為上樣溶劑，分別檢測(cè)流出液中白藜蘆醇的含量，考察印跡和非印跡萃取柱對(duì)白藜蘆醇的吸附情況。

上樣溶液中乙醇的體積分?jǐn)?shù)對(duì)白藜蘆醇吸附的影響見(jiàn)圖4。

圖4　上樣溶液中乙醇的體積分?jǐn)?shù)對(duì)白藜蘆醇吸附的影響Fig.4　Effects of the volume fraction of ethanol on resveratrol adsorption in the sample solution

由圖4可知，當(dāng)上樣溶液中乙醇的體積分?jǐn)?shù)小于40%時(shí)，印跡萃取柱均可吸附大部分白藜蘆醇，而非印跡萃取柱在乙醇體積分?jǐn)?shù)小于20%時(shí)才能吸附大部分白藜蘆醇；隨著上樣溶液中乙醇體積分?jǐn)?shù)的逐漸增加，印跡和非印跡萃取柱的負(fù)載量均開(kāi)始下降，但其在印跡聚合物上的吸附量要比在非印跡聚合物上的吸附量大?？紤]到吸附量，選擇含體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇-水溶液5 mL作為上樣溶液，該試驗(yàn)條件可確保大部分白藜蘆醇能被吸附。

淋洗液、洗脫液的選擇也非常重要。淋洗溶劑的強(qiáng)度必須達(dá)到能夠洗掉盡量多的不需要組分，但不能強(qiáng)到洗脫目標(biāo)物的程度。根據(jù)上樣溶液中乙醇的體積分?jǐn)?shù)對(duì)白藜蘆醇吸附的影響曲線，選擇40%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇-水溶液作為淋洗液、80%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇-水溶液作為洗脫液。

按上述選擇的條件進(jìn)行固相萃取操作，每隔0.5mL分別收集一次洗脫液，檢測(cè)各洗脫液中的白藜蘆醇含量，計(jì)算回收率，考察白藜蘆醇的洗脫分布情況，以確定適宜的洗脫液收集體積。

白藜蘆醇的洗脫曲線見(jiàn)圖5。

圖5　白藜蘆醇的洗脫曲線Fig.5　The elution curve of resveratrol

由圖5可以看出，白藜蘆醇集中在第1.5mL～4.5mL體積內(nèi)，因此，收集液的體積可控制在3 mL，在一定程度上起到了濃縮樣品的作用。

2.2.4虎杖提取物的分離純化

稱取2.0 g虎杖粗粉，加入60%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇20 mL，在35℃下超聲提取20 min，以水定容至50 mL，混勻、靜置，過(guò)濾。按上述分子印記固相萃取方法操作，收集洗脫液，用氮?dú)獯蹈珊笠约状既芙舛ㄈ荩酶咝б合嗌V儀檢測(cè)白藜蘆醇，并與固相萃取前的提取液對(duì)比。

虎杖提取液的色譜圖見(jiàn)圖6，洗脫液的色譜圖見(jiàn)圖7。

由圖6可以看出，虎杖提取液所含成分較多，而經(jīng)過(guò)分子印記固相萃取后，洗脫液中主要成分為白藜蘆醇，只含有少量的雜質(zhì)（圖7）。比較上樣前與洗脫后的溶液中白藜蘆醇的總量，計(jì)算出白藜蘆醇的收率為73.6%，洗脫液中白藜蘆醇的純度為89.2%。

圖6 虎杖提取液的色譜圖Fig.6　The chromatotogram of Polygonum cuspidatum extract

圖7 洗脫液的色譜圖Fig.7　The chromatotogram of the eluent

3　結(jié)論與展望

結(jié)果表明，分子印跡聚合物的Scatchard模型的功能單體與模板分子白藜蘆醇與預(yù)組織時(shí)可能存在著兩種組織方式。這使得分子印跡聚合物對(duì)模板分子具有高度的選擇性和專一的識(shí)別性，采用固相萃取法將該分子印跡聚合物直接用于復(fù)雜體系（虎杖提取液）中白黎蘆醇的分離純化，樣品僅經(jīng)一步處理，即可除去大部分雜質(zhì)，達(dá)到良好的分離效果，展示了該技術(shù)的應(yīng)用前景。

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Application and Performance Study of Molecular Imprinted Polymer of Resveratrol

FENG Tao1，LIU Peng2，LIU Hai-yan1，SUO Ran3
（1.College of Science，Agricultural Univercity of Hebei，Baoding 071000，Hebei，China；2.Experimental Management Center，Business School，Hebei Univercity，Baoding 071000，Hebei，China；3.College of Food
Science and Technology，Agricultural Univercity of Hebei，Baoding 071000，Hebei，China）

Molecular imprinting technolog was adopted to prepare resveratrol molecularly imprinted polymer，with resveratrolas template molecule，with acrylamide as functional monomer of resveratrol molecularly imprinted polymer.Mixed solution of chloroform and tetrahydrofuran were selected as solvent to synthesis molecularly imprinted polymer.The performance of the molecularly imprinted polymer，such as adsorption，selection and solid phase extraction were studied.By optimized the extraction condition of molecularly imprinted solid phase extraction，it was determined that ethanol aqueous solution（30%）5 mL was the in-flux solution，ethanol aqueous solution（40%）was spraying，ethanol aqueous solution（80%）was eluent.

polygonum cuspidatum；resveratrol；HPLC；extraction and purification；molecular imprinting

2015-08-18

科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（16ZF028）

馮濤（1980—），女（漢），實(shí)驗(yàn)師，研究生，研究方向：分析化學(xué)。