李赫宇，趙玲（.天津市益倍建生物技術(shù)有限公司，天津300457；.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢43003）

巴西蜂膠對HepG2細(xì)胞增殖抑制活性研究

李赫宇1，趙玲2
（1.天津市益倍建生物技術(shù)有限公司，天津300457；2.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023）

巴西蜂膠具有豐富而顯著的生理活性，采用MTT法對巴西蜂膠提取物進(jìn)行了HepG2細(xì)胞增殖抑制活性的研究，發(fā)現(xiàn)巴西蜂膠對HepG2細(xì)胞增殖具有良好的抑制活性，且呈顯著的量效關(guān)系和時效關(guān)系，即劑量越大、藥物作用時間越長，則對HepG2細(xì)胞的抑制率越高。

巴西蜂膠；HepG2細(xì)胞；增殖抑制活性

蜂膠（Propolis）是蜜蜂工蜂采集植物樹脂等分泌物與其上顎腺、蠟腺等分泌物混合而成的一種天然粘稠物質(zhì)。蜂膠的應(yīng)用歷史十分悠久，早在公元前300年，古埃及人就將其作為防腐物質(zhì)及防治疾病的藥物來使用?，F(xiàn)代研究表明，蜂膠含有豐富的黃酮類、酚酸類及萜烯類化合物［1-3］，具有廣泛的生物學(xué)活性和藥理學(xué)活性，如抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤、保肝、免疫調(diào)節(jié)等；目前已廣泛用于醫(yī)藥、保健品、化妝品等領(lǐng)域［4］。蜂膠在全世界范圍內(nèi)均有分布，其中，巴西因其得天獨(dú)厚的地理位置和豐富的生物資源而成為蜂膠生產(chǎn)大國。巴西蜂膠種類繁多，化學(xué)組成復(fù)雜，具有豐富而突出的生物學(xué)活性。自20世紀(jì)90年代以來，巴西蜂膠的化學(xué)組成及其生物學(xué)活性引起了國內(nèi)外蜂膠研究者的廣泛關(guān)注。惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康和生命的重大疾病之一，其發(fā)病機(jī)制及防治措施多種多樣，本文針對巴西蜂膠抗肝癌HepG2細(xì)胞增殖活性進(jìn)行研究，以期發(fā)現(xiàn)較好活性，為肝癌防治提供參考。

1　試驗(yàn)材料

1.1材料和試劑

巴西蜂膠由天津市益倍建生物技術(shù)有限公司提供；噻唑藍(lán)（MTT）：美國Sigma公司；胎牛血清：杭州四季青生物工程公司；二甲基亞砜：Sigma公司；RPMI1640、胰蛋白酶：Gibco公司。

1.2細(xì)胞株

肝癌HepG2細(xì)胞株：華中科技大學(xué)提供。

1.3試驗(yàn)儀器

酶標(biāo)儀：美國 PerkinElmer公司；CO2培養(yǎng)箱：W200IR型，美國SIM公司；倒置顯微鏡：Olympus公司；超凈工作臺：ZHJH-1112B型，上海智誠分析儀器制造有限公司。

2　方法

2.1藥物制備

巴西蜂膠以80%乙醇浸泡24 h，低溫回收乙醇，制得提取物。巴西蜂膠提取物適量以1 mL（DMSO）二甲基亞砜溶解，過濾除菌，置4℃冰箱保存，臨用前用培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。

2.2HepG2細(xì)胞培養(yǎng)

將恒溫水浴鍋的溫度設(shè)置為37℃，在-80℃的低溫冰箱里取出已凍存的肝癌HepG2細(xì)胞株，放入恒溫水浴鍋中進(jìn)行水浴，同時不停搖晃，使細(xì)胞迅速融化。3 min后凍存管內(nèi)成液體狀態(tài)，取出后防止污染可用酒精棉擦拭。放入超凈工作臺后，取出離心管并加入3 mL的培養(yǎng)基，反復(fù)吹打后將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液加入離心管里，吹勻后放入離心機(jī)（1 500 r/min，10 min）。離心后在超凈工作臺內(nèi)操作，倒掉離心管內(nèi)的上清液，加入1 mL培基后分裝到3個中型培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)，每瓶加入6 mL培養(yǎng)基。將中型培養(yǎng)瓶放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

2.3MTT法測定抑制率

2.3.1鋪板

觀察細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞成對數(shù)生長期后，用胰酶消化，倒掉胰酶后，加入3 mL培養(yǎng)基終止消化，用吸管反復(fù)吹打但不要產(chǎn)生泡沫，將瓶壁的細(xì)胞吹落。吹勻后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，經(jīng)計(jì)算配成3×104個/mL懸液，將細(xì)胞懸液接種于96孔板內(nèi)，每孔100 μL（3×104個/mL）．放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。

2.3.2給藥

在超凈工作臺內(nèi)用RPMI 1640稀釋巴西蜂膠提取物母液，配置成6個質(zhì)量濃度，分別為2.18、1.09、0.5 45、0.2727、0。136 35、0.068 175 g/mL。每個質(zhì)量濃度設(shè)置6個平行孔，每孔加入100 μL藥物，空白孔加100 μL（3×104cell）的細(xì)胞懸液后，加入100 μL的RPMI 1640，平行條件下鋪3塊板。

2.3.3MTT法測定

將分別培養(yǎng)24、48、72 h的96孔板取出，倒掉板孔內(nèi)液體，再在每孔加入10 μL MTT，放入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4h后取出96孔板。吸去孔內(nèi)MTT后，每孔再加入110 μL的Formazan溶解液，震蕩儀上震蕩10 min，使孔內(nèi)結(jié)晶充分溶解。570 nm波長下酶標(biāo)儀檢測。

2.3.4計(jì)算公式

HepG-2細(xì)胞生長抑制率/%=（1-給藥孔OD值/空白孔OD值）×100

2.3.5數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)采用SPSS19.0進(jìn)行分析，使用ANOVA方差分析方法、兩樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，結(jié)果以x±S表示。

3　結(jié)果

MTT結(jié)果顯示不同質(zhì)量濃度的巴西蜂膠分別培養(yǎng)24、48、72 h后，對HepG2細(xì)胞有明顯抑制作用。當(dāng)巴西蜂膠濃度大于等于0.272 7 mg/mL并培養(yǎng)48小時和72小時后，對HepG2細(xì)胞的抑制率均大于50%。當(dāng)濃度增大為2.18 mg/mL時，作用24 h其抑制率即大于50%，具體數(shù)據(jù)見表1。巴西蜂膠相對應(yīng)的IC50值經(jīng)計(jì)算，分別為1.395 7、0.323 6、0.025 2mg/mL。各實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨著濃度增大和作用時間延長，巴西蜂膠對HepG2細(xì)胞增殖抑制存在著顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系和時間-效應(yīng)關(guān)系（P＜0.05），見圖1。

表1　巴西蜂膠對HepG2細(xì)胞的抑制率（x±SD，n=6）Table 1　Inhibitory rate of Brazilian propolis on HepG2 cells（x±SD，n=6）

圖1 巴西蜂膠對HepG2細(xì)胞的抑制率曲線Fig.1　Inhibition curve of Brazilian propolis on HepG2 cells

4　結(jié)論與討論

通過本實(shí)驗(yàn)可以看出，巴西蜂膠體外具有良好的抑制HepG2細(xì)胞增殖的活性，且隨著濃度的增加，作用時間的延長，對HepG2細(xì)胞的抑制率越高，在濃度為2.18 mg/mL時，其作用48 h和72 h的抑制率分別可達(dá)81.67%和93.86%，但是其在體內(nèi)是否較好的抗肝癌活性及作用機(jī)制尚不清楚，仍需進(jìn)一步深入研究。

我國是一個肝病大國，每年的肝癌發(fā)病率及病死率均占全球一半以上［5］，現(xiàn)有的抗肝癌藥物大都存在各種毒副作用。蜂膠是衛(wèi)生部公布的可用于保健食品中的物品之一，具有較高的安全性［6］。且文獻(xiàn)報道其還有提高免疫的作用，在人們?nèi)找孀非蠼】档臅r代，具有極大的開發(fā)為防治肝癌的藥品及保健食品的潛力，這對人類健康有著非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

［1］張翠平，胡福良．蜂膠中的黃酮類化合物［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2009，21（6）：1084-1090

［2］張翠平，胡福良．蜂膠中的萜類化合物［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2012，24（7）：976-984

［3］Zhang C，Wang K，HU Fuliang．Phenolic acid in propolis［J］．Chin J Mod Appl Pharm，2013，30（1）：102-105

［4］VS Bankova，SLD Castro，MC Marcucci.Propolis：recent advances in chemistry and plant origin［J］.Apidologie，2000，31（1）：3-15

［5］梁宏元，盧再鳴.原發(fā)性肝癌綜合介入治療現(xiàn)狀與困惑［J］.臨床肝膽病雜志，2016，32（1）：44-48

［6］程曉雨，胡福良.我國蜂膠保健食品概況［J］.中國蜂業(yè)，2015，66 （4）：45-47

Study on the Proliferation Inhibitory Activity of Brazilian Propolis on HepG2 Cell

LI He-yu1，ZHAO Ling2
（1.Tianjin Ubasic Health Nutrition Co.，Ltd.，Tianjin 300457，China；2.School of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，Hubei，China）

The Brazilian propolishas rich and significant physiological activity.The proliferation inhibitory activityof Brazilian propolis extracts on HepG2 cell was studied with the MTT assay.It was found that the Brazil propolis had good inhibitory activity on the proliferation of HepG2 cells，and showed a significant dose effect and time effect relationship，that was，the higher the dose，the longer the action time，the higher the inhibition rate of HepG2 cells.

Brazil propolis；HepG2 cell；proliferation inhibition activit

2016-07-12

李赫宇（1982—），男（漢），工程師，碩士研究生，研究方向：天然藥物和功能性食品的開發(fā)。